Expressão e purificação das proteases 3CLPRO e PLPRO de SARS-CoV-2 e identificação de compostos provenientes da biodiversidade brasileira como potenciais inibidores virais - Constant, Larissa Esteves Carvalho (UFRJ, 2022)
[PT] A COVID-19 é a doença caracterizada por uma síndrome respiratória aguda grave causada pelo novo coronavírus 2 (SARS-CoV-2. Considerando a possibilidade de surgimento de novas variantes fora da cobertura vacinal, a iminência de novas ondas e a ausência de medicamentos capazes de atuar em casos leves e moderados, há necessidade de alternativas de manejo clínico afim de controlar a evolução da doença e reduzir a necessidade de internação. O SARS-CoV-2 é um vírus de RNA policistrônico com polaridade positiva e genoma de aproximadamente 30 kb. O RNA viral possui dois quadros de leitura abertos (ORFs, do inglês open reading frames) que originam uma poliproteína contendo as proteínas responsáveis pela replicação viral e um RNA subgenômico que codifica proteínas estruturais. Dentre as proteínas não estruturais, duas proteases são essenciais para a replicação viral: a 3CLpro e a PLpro. Juntas, elas são responsáveis por clivar a poliproteína viral em dezesseis proteínas individuais que formam o complexo de replicação e são responsáveis pela modulação da fisiologia celular em favor da infecção. Portanto, essas proteases constituem alvos interessantes para o desenvolvimento de inibidores virais. O objetivo desse trabalho é a produção recombinante das proteases 3CLpro e PLpro enzimaticamente ativas em Escherichia coli para posterior utilização na triagem de novos compostos com atividade antiviral. Para obtenção das proteases, os genes que codificam a 3CLpro e PLpro de SARS-CoV-2 foram sintetizados e clonados em plasmídeo pET28a. As condições de expressão das enzimas foram otimizadas para melhorar o rendimento final das proteínas purificadas. As cepas BL21(DE3)pLysS e BL21(DE3) foram identificadas como as melhores cepas para produção da 3CLpro e PLpro, respectivamente.A purificação das proteínas foi realizada em uma coluna de afinidade de histidina (HisTrap) e as atividades enzimáticas de ambasas proteases foram avaliadas por ensaio fluorimétrico com peptídeo substrato marcado com fluoróforos. Os parâmetros cinéticos das enzimas foram calculados com valores de Km = 41,5 µM e Vmax = 0,01375 µM/s para 3CLpro e Km = 26,13 µM e Vmax = 0,003219 µM/s para PLpro. A análise do estado oligomérico das proteases foi avaliada por cromatografia de exclusão por peso molecular e o resultado indicou que ambas as enzimas foram expressas como monômeros. Os resultados in vitro mostram que extratos das famílias Siparunaceae e Rhamnaceae, constituídos principalmente por alcalóides, flavonóides e saponinas, têm efeito inibitório sobre a atividade dessas proteases chegando a até 80% de inibição. Os flavonóides retusina e kumatakenina isolados de extratos de Siparuna cristata promoveram atividade inibitória frente à 3CLpro e PLpro com IC50 aparente de 3,25 μM e 0,006204 μM respectivamente. Após a triagem desta biblioteca de produtos naturais, os extratos que promoverem os melhores resultados com IC50 aparente ≤ 0,1 μg/mL) serão selecionados para investigação das substâncias específicas presentes nestes extratos responsáveis pela inibição da atividade das enzimas 3CLpro e PLpro.[EN] COVID-19 is a disease characterized by severe acute respiratory syndrome caused by the new coronavirus 2 (SARS-CoV-2. Considering the possibility of the emergence of new variants outside the vaccine coverage, the imminence of new waves, and the absence of drugs capable of acting in mild and moderate cases, there is a need for clinical management alternatives to control the evolution of the disease and reduce the need for hospitalization. SARS-CoV-2 is a polycistronic RNA virus with positive polarity and a genome of approximately 30 kb. Viral RNA has two open reading frames (ORFs) that give rise to a polyprotein containing the proteins responsible for viral replication and a subgenomic RNA that encodes structural proteins. Among the non-structural proteins, two proteases are essential for viral replication: 3CLpro and PLpro. Together they are responsible for cleaving the viral polyprotein into sixteen individual proteins that form the replication complex and are responsible for modulating cell physiology in favor of infection. Therefore, these proteases are interesting targets for the development of viral inhibitors. The objective of this work is the recombinant production of enzymatically active proteases 3CLpro and PLpro in Escherichia coli for further use in screening new compounds with antiviral activity. To obtain the proteases, the genes encoding 3CLpro and PLpro of SARS-CoV-2 were synthesized and cloned into plasmid pET28a. Enzyme expression conditions were optimized to improve the final yield of purified proteins. The BL21(DE3)pLysS and BL21(DE3) strains were identified as the best strains for the production of 3CLpro and PLpro, respectively. Protein purification was performed on a histidine affinity column (HisTrap), and the enzymatic activities of both proteases were evaluated by fluorimetric assay with fluorophore-labeled substrate peptide.The kinetic parameters of the enzymes were calculated with values of Km = 41.5 µM and Vmax = 0.01375 µM/s for 3CLpro and Km = 26.13 µM and Vmax = 0.003219 µM/s for PLpro . The oligomeric state of the proteases was evaluated by size-exclusion chromatography, and the result indicated that both enzymes were expressed as monomers. In vitro results show that extracts from the Siparunaceae and Rhamnaceae families, consisting mainly of alkaloids, flavonoids, and saponins, have an inhibitory effect on the activity of these proteases, reaching up to 80% inhibition. The flavonoids retusin and kumatakenin isolated from extracts of Siparuna cristata promoted inhibitory activity against 3CLpro and PLpro with apparent IC50 of 3.25 μM and 0.006204 μM, respectively. After screeningthis library of natural products, the extracts that promote the best results with apparent IC50 ≤ 0.1 μg/mL will be selected to investigate the specific substances present in these extracts responsible for inhibiting the activity of 3CLpro and PLpro enzymes.