Obtenção de linhagens celulolíticas mutantes do fungo Penicillium sp. I7-5 isolado da Mata Atlântica - Oliveira, Matheus Uchôa (UFRJ, 2020)
[PT] Fungos filamentosos são microrganismos eucarióticos, metabolicamente versáteis, capazes de produzir diversos biocompostos, como enzimas, antibióticos, pigmentos, entre outros. Os gêneros com potencial biotecnológico mais reportados são Aspergillus, Trichoderma e Penicillium. Estes fungos podem ser encontrados em biomas como Floresta Equatorial, Ambientes Costeiros, Mata Atlântica, além da Serra da Mantiqueira, onde se encontra o Parque Nacional de Itatiaia, de onde foram isolados, neste trabalho, um total de 165 linhagens. Dentre elas, a linhagem Penicillium sp. I7-05, isolada de amostra de solo coletada no Planalto das Agulhas Negras, Itatiaia – RJ ( 2.400m de altitude), apresentou uma elevada atividade celulolítica quando cultivada sobfermentação submersa. Deste modo, se utilizando de dados obtidos em estudos anteriores quantoao seu potencial celulolítico utilizando outros sub-produtos da agro-indústria como palha de bananeira, o presente trabalho teve por objetivo obter uma maior atividade celulolítica para o isolado Penicillium sp. I7-05 se utilizando de agentes mutagênicos físicos e químicos (radiação U.V. e 1-metil-3- nitro-1-nitrosoguanidina) na obtenção de linhagens mutantes com tal atividade enzimática melhorada. Os dois agentes mutagênicos foram utilizados de forma concomitante sobre a suspensão de esporos do fungo Penicillium sp. I7-05, devidamente padronizada (108 esporos.mL-1), obtendo ao final do processo 237 linhagens mutantes. Para confirmar a melhoria no potencial celulolítico, as linhagens foram inoculadas em Placa de Petri contendo meio de sais de mandels modificado, suplementado com carboximetilcelulose (CMC) e tubos de ensaio contendo meio de sais suplementado com celulose-azure na superfície do meio. Duas linhagens mutantes (NTGU-210 e NTGU-6) foram selecionadas para um novo estudo fermentativo utilizando palha de cana e milhocina como matérias-primas.Foi realizado um planejamento central composto rotacional (DCCR) com as duas linhagens devido a ter sido utilizado em testes anteriores para a avaliação do potencial celulolítico com a linhagem selvagem.Portanto, as atividades de CMCase, FPase e β-glicosidase foram determinadas por fermentação submersa nas seguintes condições, 28ºC / 5 dias / 180 rpm, em sub-produtos da agro-indústria (palha de cana-de-açúcar e milhocina). Os resultados obtidos pelas linhagens mutantes NTGU-6 e NTGU-210 foram 825 U.L-1 e 1.414 U.L-1 (CMCase), 236 U.L-1 e 741 U.L-1 (FPase), 7.767 U.L-1 e15.488 U.L-1 (-glicosidase), respectivamente, já a linhagem selvagem obteve valores de atividade enzimática de 1.871,0 U.L-1 (CMCase), 938 U.L-1 (FPase) e 13.000,0 U.L-1 (β-glicosidase). De acordo com os resultados obtidos foi possível observaruma melhora de suas próprias atividades enzimáticas, em especial da atividade β- glicosidásica do mutante NTGU-210 a partir da degradação de biomassa vegetal, sendo superior a atividade otimizada da linhagem selvagem, por conseguinte, um novo potencial para o desenvolvimento de processos fermentativos. Portanto, novos testes para uma melhor compreensão quanto às características fisico-quimicas do mutante deverão ser idealizados em prol desse propósito.[EN] Filamentous fungi are eukaryotic microorganisms, metabolically versatile, capable of producing several bioactive products, such as enzymes, antibiotics, pigments, among other composites. The genera with the most reported biotechnological potential are considered to be Aspergillus, Trichoderma and Penicillium. These fungi can be found in most diverse biomes such as Equatorial Forest, Coastal Environments and in the Atlantic Forest, a good example is the Itatiaia National Park, which is located on Serra da Mantiqueira. From 165 strains collected of its regions, the strain Penicillium sp. I7-05, isolated specifically from a soil sample collected at the high altitude region, specifically at the Agulhas Negras Plateau, Itatiaia - RJ (> 2,400m altitude), presented a high cellulolytic activity when cultivated under submerged fermentation (28ºC / 5 days / 180 rpm) utilizing agro-industrial by-products (sugarcane straw and corn steep solids), reaching enzyme activity values of 1,871.0 U.L-1 (CMCase), 938 U.L-1 (FPase) and 13,000.0 U.L-1 (β-glucosidase). Previous studies have already demonstrated the cellulolytic potential of this strain using other by-products such as banana straw. Thus, in order to improve its cellulases yield, it was determined that the wild strain Penicillium sp. I7-05 would be submitted to a genetic mutation process through the effect of physical and quimical mutagenic agents, (U.V. radiation together with 1-methyl-3- nitro-1-nitrosoguanidine solution) for the obtention of new mutant strains. Through standardized procedure, a spore suspension containing 108 spores.mL-1 was put in the presence of both mutagens concurrently, obtaining 240 mutant strains at the end of the process.To confirm the improvement in cellulolytic potential, the strains were tested through Congo red method with modified mandells salts, supplemented with carboxymethylcellulose (CMC) and through test tubes containing salt medium supplemented with cellulose-azure on the surface of the medium. Two mutant strains (NTGU-210 and NTGU-6) were selected and then prepared for a new fermentative study using cane straw and corn steep solids. A Central composite rotational planning (CCRD) was carried out with the two strains, the activities of CMCase, FPase and β-glucosidase determined. The results obtained by the mutant strains NTGU-6 and NTGU-210 were 825 U.L-1 and 1,414 U.L-1 (CMCase), 236 U.L-1 and 741 U.L-1 (FPase), 7,767 U.L-1 and 15,488 U.L-1 (β-glucosidase), respectively. According to the results obtained, it was possible to observe an improvement of the mutants own enzymatic activities, especially on the β-glucosidase activity of the NTGU-210 mutant following the degradation of vegetal biomass, being superior to the optimized activity of the wild strain, configuring a new potential in the development of fermentative processes. Therefore, new tests for a better understanding as to the physic-chemical characteristics of the mutants should be conducted.