Bactérias associadas às esponjas marinhas : isolamento, caracterização e análise da capacidade de produção de substâncias antimicrobianas e biossurfactantes - Silva, Jéssyca Freitas (UFRJ, 2019)
[PT] Estudos recentes revelam que o uso de antibióticos tem acelerado o crescimento de bactérias resistentes e em contrapartida tem-se ampliado a busca por novas substâncias bioativas. Paralelamente, as preocupações com a recuperação do meio ambiente contaminado, principalmente por óleos, ampliaram também a busca por biossurfactantes. As bactérias associadas às esponjas são uma fonte de novas substâncias com potencial biotecnológico, como antimicrobianos e biossurfactantes. Portanto, o presente estudo visou isolar e identificar bactérias associadas às esponjas Chondrilla caribensis, Plakina cyanorosea e duas espécies do gênero Darwinella; caracterizar as bactérias produtoras de substâncias com atividade antimicrobiana (SAM) e biossurfactante, e por fim sequenciar o genoma da estirpe que apresentar o melhor potencial antimicrobiano. A partir das amostras de esponjas coletadas no litoral da cidade de Cabo Frio, RJ, em 2015, foram isoladas e selecionadas 119 colônias, sendo observadas diferentes morfologias. Destas, 69 estirpes permaneceram viáveis após a criopreservação. Dos cinco meios de cultura utilizados, o BHI apresentou o maior número de bactérias isoladas, 48 (40%). As bactérias foram identificadas por MALDI-TOF MS e pelo sequenciamento do gene rrs, (16S rRNA), sendo 51% das estirpes pertencentes ao filo Firmicutes e 49% pertencentes ao filo Proteobacteria. Destas, 13 estirpes marinhas, identificadas como Vibrio sp. (5) e Bacillus spp. (8) apresentaram produção de SAM contra Staphylococcus aureus ATCC 29213.A atividade inibitória destas 13 estirpes bioativas também foi observada contra estirpes patogênicas e/ou resistentes a antimicrobianos, como Staphylococcus epidermidis formador de biofilme, Citrobacter freundii resistente a aminoglicosídeos, beta-lactâmicos, macrolídeos e quinolonas, S. epidermidis resistente à meticilina (MRSE), Escherichia coli resistente à ampicilina, cloranfenicol, sulfametoxazol /trimetoprim e tetraciclina, Klebsiella pneumoniae resistente a aminoglicosídeos e Enterococcus sp. resistente à vancomicina (VRE) e à teicoplanina, dentre outras. Duas estirpes marinhas destacaram-se durante o desenvolvimento do presente estudo e foram caracterizadas como descrito a seguir. A estirpe Bacillus subtilis 84BHI1:105 apresentou morfologia colonial com uma cápsula espessa semelhante a uma “bolsa líquida”. Esta estirpe apresentou atividade antimicrobiana contra estirpes de Staphylococcus spp. e índices de emulsificação de 5% em óleo mineral e 25% em n-hexadecano, sendo positiva também no teste de colapso da gota e de hidrofobicidade celular. A segunda estirpe de destaque, Bacillus pumilus 64BHI1 apresentou um amplo espectro de atividade inibitória, inibindo 11 das 15 estirpes indicadoras testadas. Deste modo, a partir da determinação das melhores condições de meio de cultivo, temperatura e estabilidade térmica da SAM produzida por B. pumilus 64BHI1, foi possível realizar extrações a partir da cultura com solventes orgânicos e análises em cromatografia de camada delgada acompanhada por bioensaios. A partir do extrato obtido em metanol a SAM demonstrou uma concentração mínima inibitória de 29,6 μg/mL e atividade bacteriostática sobre S. aureus.Paralelamente, o genoma completo dessa estirpe foi sequenciado (Illumina NextSeq500), montado e anotado, identificando 12 clusters gênicos biossintéticos, incluindo policetídeo sintases (PKS) do tipo I e III, peptídeos sintetases não ribossomais (NRPS) e um híbrido NRPS-T1PKS, dentre outros. Estes resultados demonstram que B. pumilus 64BHI1 e B. subtilis 84BHI1:105 são estirpes promissoras para pesquisas de produção de substâncias antimicrobianas e biossurfactantes com diferentes aplicações biotecnológicas, como em indústrias farmacêuticas e em processos de biorremediação.[EN] Recent research shows that the use of antibiotics has accelerated the appearance of resistant bacteria and, in contrast, has expanded the search for new bioactive substances. Simultaneously, the interest about the environment contaminated by oils has also extended the search for biosurfactants. Sponge-associated bacteria are a source of new substances with biotechnological potential, such as antimicrobials and biosurfactants. Therefore, the present study aimed to isolate and identify bacteria associated with the sponges Chondrilla caribensis, Plakina cyanorosea and two species of Darwinella genera; to characterize the bacteria that produce antimicrobial and biosurfactant substances, and to sequence the whole genome of the strain presenting the best antimicrobial potential. One hundred and nineteen colonies from the sponge samples collected in the coast of Cabo Frio city, RJ, were isolated from 5 different culture media. After cryopreservation, 69 strains remained viable. The colonies showed different morphologies and the recovery of bacteria was higher with the BHI medium (48, 40%). All bacteria were identified by MALDI-TOF MS and by sequencing of the rrs gene (16S rRNA), with 51% of bacteria belonging to the Firmicutes phylum and 49% of bacteria belonging to the Proteobacteria phylum. Among the marine strains, 13 were identified as Vibrio sp. (5) and Bacillus spp. (8), which showed production of an antimicrobial substance against Staphylococcus aureus ATCC 29213.The inhibitory activity of these 13 bioactive strains was also observed against pathogenic and/or antimicrobial resistant strains, such as biofilm-forming Staphylococcus epidermidis, Citrobacter freundii resistant to aminoglycosides, beta-lactams, macrolides and quinolones; methicillin resistant S. epidermidis (MRSE), Escherichia coli resistant to ampicillin, chloramphenicol, sulfamethoxazole / trimethoprim and tetracycline, Klebsiella pneumoniae resistant to aminoglycosides and Enterococcus sp. resistant to vancomycin (VRE) and teicoplanin, among others. Two marine strains were notable during the development of the present study and were better characterized. As an exemple, the strain Bacillus subtilis 84BHI1:105 presented a thick capsule similar to a “liquid bag”. This strain showed antimicrobial activity against strains of Staphylococcus spp., and presented emulsification rates of 5% in mineral oil and 25% in n-hexadecane, being also positive in the test of drop collapse and cellular hydrophobicity. The second prominent strain, Bacillus pumilus 64BHI1 showed a larger spectrum of inhibitory activity, inhibited 11 of the 15 indicator strains tested. Thus, after the determination of the best growth conditions, such as culture medium, temperature and thermal stability of the bioactive substance, it was possible to obtain bioactive extracts from the cultures, using organic solvents and to analyze them in a thin layer chromatography followed by bioassays. The bioactive extract obtained from methanol demonstrated a minimum inhibitory concentration of 29.6 μg/ml and bacteriostatic activity against S. aureus cells. In parallel, the complete genome of this strain was genome whole sequenced (Illumina NextSeq500), assembled and annotated.About 12 biosynthetic gene clusters, including polyketide synthases (PKS) of type I and III, non-ribosomal peptides (NRPS), a NRPS-T1PKS hybrid, among others, were identified. These results demonstrate that B. pumilus 64BHI1 and B. subtilis 84BHI1:105 are promising strains for researching antimicrobial and biosurfactant substances with promise in biotechnological applications, such as pharmaceutical industries and in bioremediation processes.