Detecção de anticorpos anti-ARFP como biomarcador de progressão de fibrose hepática em pacientes com hepatite C - Souza, Suiane Lima de (UFRJ, 2018)
[PT] Estima-se que 71 milhões de pessoas estejam infectadas com o vírus da hepatite C (HCV) no mundo e, por ano, 400 mil pessoas morrem de doenças relacionadas à infecção pelo HCV. Durante a fase crônica, há progressão da fibrose hepática, e o paciente pode desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). A fibrose pode ser classificada em uma escala com cinco níveis, de F0, sem fibrose, até F4, que é a cirrose. Apesar dos tratamentos disponíveis terem uma alta taxa de cura, o CHC pode se desenvolver mesmo quando em indivíduos curados da infecção. Alternative Reading Frame protein (ARFp) é uma proteína viral sintetizada pelo quadro de leitura alterativo -2/+1 na região do core. Essa proteína é expressa durante a infecção do HCV e estimula respostas imune específicas, sendo reconhecida por anticorpos e células T de memória. Recentemente alguns de seus mecanismos na carcinogênese foram elucidados, como a aceleração do ciclo celular e aumento dos focos de tumor. Estudos prévios mostraram uma alta prevalência de anticorpo contra essa proteína em pacientes com CHC comparado com pacientes sem CHC, mas não considerou os diferentes níveis de fibrose no grupo dos pacientes sem CHC. O presente estudo teve como objetivo detectar anticorpo anti-ARFp em pacientes portadores de HCV com diferentes níveis de fibrose como biomarcador da progressão da doença hepática. Soro de 279 pacientes foram coletados, dos quais 4 são F0, 74 F1, 54 F2, 51 F3, 83 F4 sem CHC e 13 F4 com CHC. Três plasmídeos contendo as sequências de ARFp genótipo 1, ARFp genótipo 3 e core genótipo 1 foram usados nesse trabalho. Os plasmídeos foram transformados em E.coli BL21 (DE3) para expressar as proteínas com IPTG. As proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade e foram usadas para a realização do teste ELISA.A proteína core foi usada como controle positivo do teste. Não houve diferença entre as proporções de anticorpos anti-ARFp entre os grupos F1 e F2 (21% e 18% de positivos, respectivamente) e entre F3 e F4 (39% e 42% de positivos, respectivamente). Ao dividir os pacientes em dano hepático brando (F0 a F2) e dano hepático avançado (F3 e F4), houve uma proporção significativamente maior de anticorpos anti-ARFp no grupo com doença avançada, com 41% de positivos, comparado a 20% no grupo de F0 a F2. Comparando pacientes cirróticos com e sem CHC, também houve uma proporção maior de sorologia positiva para ARFp no grupo com CHC, com 91% de positivos. Concluímos que a presença de anticorpo anti-ARFp é um marcador biológico de progressão de fibrose hepática em pacientes infectados com HCV.[EN] It is estimated that 71 million people are infected with Hepatitis C virus (HCV) worldwide and per year 400,000 people die from diseases related to HCV infection. In chronic hepatitis C, there is progression of liver fibrosis, which can develop to cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Fibrosis can be classified in a five level severity scale, from F0, without fibrosis, to F4, which is cirrhosis. Although available treatments have high cure rates, HCC still can develop even after clearance of infection. Alternative Reading Frame protein (ARFp) is a viral protein synthesized by an alternative reading frame -2 / + 1 in the region encoding the core. This protein is expressed during natural HCV infections and stimulates specific immune responses, being recognized by serum antibodies and T-memory cells. Recently, some of its mechanisms in carcinogenesis were elucidated, such as cell cycle acceleration and increased of tumor foci. Previous studies have shown a higher prevalence of anti-ARFp antibodies in patients with HCC compared to patients without HCC but did not consider the different stages of fibrosis within the non-HCC group. The present study aims to detect anti-ARFp antibodies in HCV positive patients with different levels of fibrosis as a biomarker of progression of hepatic disease. Serum of 279 patients were collected, of which 4 were F0, 74 F1, 54 F2, 51 F3, 83 F4 without HCC and 13 F4 with HCC. Three plasmids containing the sequences of ARFp genotype 1a, ARFp genotype 3a and core genotype 1a were used in this study. The plasmids were transformed into E.coli BL21 (DE3) to express the ARF and core proteins with IPTG. Proteins purification by affinity chromatography and they were used to perform the immunological assay ELISA.The core protein was used as positive control of the assay. There was no difference in the proportions of anti-ARFp antibodies between F1 and F2 groups (21% and 18% positive, respectively) and between F3 and F4 (39% and 42% positive, respectively). Dividing patients into mild hepatic injury (F0 to F2) and advanced liver injury (F3 and F4), there was a significantly higher proportion of anti- ARFp antibodies in the advanced disease group, with 41% positive, compared to 20% in the group with F0 to F2. Comparing cirrhotic patients with and without HCC, there was also a higher proportion of positive serology for ARFp in the HCC group, with 91% positive. We conclude that the presence of anti-ARFp antibody is a biological marker of progression of liver fibrosis in HCV positive patients.