Detecção de genes de virulência e caracterização do gene SASX-LIKE em cepas de Staphylococcus haemolyticus. - Alves, Amanda Vieira Araujo (UFRJ, 2015)
[PT] Staphylococcus haemolyticus tem emergido como um importante patógeno sendo, entre os Staphylococcus coagulase negativos (SCN), o segundo mais isolado de hemoculturas humanas. Entretanto seus fatores de virulência e o seu possível papel como reservatório de genes para cepas de S. aureus têm sido pouco explorado. O presente estudo teve como objetivo detectar e caracterizar genotipicamente genes de virulência, já descritos em S. aureus,em cepas clínicas de S. haemolyticus,e ainda buscar indícios in silico de transmissão horizontal e do possível papel desta espécie como reservatório destes genes. Para a realização do trabalho, foram utilizadas 62 amostras clínicas de S. haemolyticus. A pesquisa de genes comumente associados à virulência foi feita pela PCR para a detecção de enterotoxinas (seasej), toxina da síndrome do choque tóxico -1 (tst), toxinas esfoliativas (eta, etb) e leucocidina Panton-Valentine (pvl). Entretanto, os genes que codificam as exoproteínas analisadas não foram detectados. A pesquisa também incluiu um gene de virulência recentemente descrito em S. aureus (sasX) e S. epidermidis (sesI). Um fragmento do gene homólogo a sasX, foi detectado em 53,22% das amostras (33/62),destas duas tiveram seus produtos de PCR sequenciados. As sequências apresentaram alta identidade com sasX (95%) e sesI (98%). Novos iniciadores foram desenhados afim de determinar a sequência completa do gene e verificar se este estava inserido em um profago Φ SPβ–like conforme anteriormente descrito para S. aureus e S.epidermidis. Entre as 33 amostras, 7 apresentaram-se no mesmo contexto genético e uma delas (MD43) teve os produtos da PCR sequenciados. Desta forma, obteve-se a sequência do novo gene descrito em S. haemolyticus,denominado shsA (sasX-like).Entre os que não tiveram o contexto genético confirmado, foi selecionada uma estirpe (MD49) para ter o genoma sequenciado. A partir disso, verificou-se que o gene shsA(sasX-like) não está associado ao profago Φ SPβ-like, e encontra-se flanqueado pelas sequências de inserção (IS) IS1272 e ISSha1. Outras análises in silico foram ainda realizadas na cepa sequenciada em busca de genes de exoproteínas bem como de genes CRISPR. Este último envolvido na atividade do sistema de restrição e consequentemente aquisição de novos genes, entre eles genes de virulência. Foram encontrados no genoma da cepa MD49, 12 sequências com homologia para genes de proteínas do sistema CRISPR e 3 possíveis sequências CRISPR. Para a busca de enterotoxinas no genoma, também foram encontradas 12 possíveis sequências de enterotoxinas no mesmo. As análises permitiram detectar um novo gene possivelmente ligado a virulência em S. haemolyticus, assim como um novo contexto genético relacionado ao mesmo. Além disso, a detecção de genes possivelmente ligados a CRISPR enfraqueceriam a hipótese deste gene ter sido adquirido a partir de S. aureus, mas não descartaria a hipótese inversa. A detecção de possíveis sequências de enterotoxinas no genoma da cepa MD49 poderia sugerir, que em algumas ocasiões, a detecção destes genes por PCR poderia estar sendo subestimada.[EN] Staphylococcus haemolyticus has emerged as an important pathogen and it is the second most frequently species isolated from human blood cultures among coagulase-negative staphylococci (CoNS). However, its virulence factors and the possible role as a Staphylococcus aureus genes reservoir has been underexplored. The aim of this study was to detect and characterize genotypically virulence genes that have been already described in S. aureus, in clinical strains of S. haemolyticus. Additionally, in silico analysis was performed to check for evidences of horizontal transfer and the possible role of this specie as a reservoir for virulence genes. In the present study were included 62 clinical samples of S. haemolyticus. PCR was used to check genes commonly associated with virulence including enterotoxins (sea-sej), toxic shock syndrome toxin 1 (tst), exfoliative toxins (eta, etb) and Panton-Valentine leukocidin (pvl). The genes encoding exoproteins were not detected. However, a virulence gene recently described in S. aureus (sasX) and S. epidermidis (sesl) were also checked and a fragment of homologous sasX gene was detected in 53,22% strains (33/62) and two amplicons of those were sequenced. The sequences showed homology to sasX (95%) and sesl (98%). Then, new primers were designed aiming to recovering the complete sequence of the gene and also to check if it was inserted into a prophage Φ SPβ–like, as previously described in S. aureus and S. epidermidis. Among the 33 strains, 7 presented the same genetic environment and one of them (MD43) was selected for sequencing the amplicons. The sequence of the new gene was determined in S. haemolyticus and named as shsA (sasX-like). Among the strains with unconfirmed genetic environment, we selected one (MD49) to sequence the genome.In that genome, the shsA (sasX-like) gene was not inserted into Φ SPβ– like prophage, but it is flanked by the insertion sequences (IS) IS1272 and ISSha1. Moreover, we performed another in silico analysis in order to check for exoproteins and CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) genes. The latter is involved in restriction system activity and consequently acquisition of new genes, including virulence genes. It was found in the MD49 genome, 12 sequences with homology to genes from the CRISPR system and 3 possible CRISPR sequences. In total, 12 possible enterotoxins sequences in MD49 genome were discovered. The analysis allowed the detection of a new gene possibly involved in S. haemolyticus virulence and present in a new genetic environment. Furthermore, the detection of genes possibly belonging to CRISPR family gives a remote possibility that those genes have been transferred by S. aureus, but does not rule out the inverse. The detection of possibly enterotoxins sequences in the MD49 genome might suggest that in some cases, the detection of these genes by PCR could be underestimated.