Caracterização bioquímica do transporte de fosfato inorgânico em Giardia duodenalis. - Araújo, Ayra Diandra Carvalho de (UFRJ, 2018)
[PT] Giardia duodenalis é um protozoário flagelado que habita o intestino de hospedeiros vertebrados, causando a doença conhecida como giardíase, que é a causa mais comum de diarreia em todo o mundo em especial em países em desenvolvimento. A infecção tem início pela ingestão de cistos, seguida pelo desencistamento e pela colonização do intestino delgado pelos trofozoítos, os quais são os responsáveis pelo quadro clínico da doença. Assim como os outros parasitas, G. duodenalis precisa perceber as mudanças ambientais para sobreviver, entre essas mudanças há a disponibilidade de fosfato inorgânico (Pi). O Pi é um nutriente essencial para todos os organismos, por participar do processo de formação de biomoléculas, armazenamento de energia e formação de estruturas celulares. O Pi é uma molécula aniônica que não é capaz de se difundir pela membrana por difusão simples, por isso é necessário a presença de transportadores de Pi na membrana celular, que facilitem a entrada deste nutriente na célula, que será utilizado posteriormente no metabolismo celular. O objetivo desta dissertação foi caracterizar bioquimicamente o transporte de fosfato em G. duodenalis. Para quantificar o transporte de fosfato inorgânico (Pi) trofozoítos foram crescidos em meio TYI-S-33 com adição de 10% de soro fetal bovino à 37°C por 48h. A incorporação de Pi foi medida pelo método de filtração rápida de células vivas incubadas com 32 Pi por 15 minutos. Nós identificamos uma sequência de transportador do tipo simporter Proton:Fosfato (H + :Pi) (Genbank ID: GL50803_5164) em G. duodenalis, que nomeamos GdPho84, homóloga ao encontrado em Saccharomyces cerevisiae (PHO84).O transporte de Pi foi linear até o tempo de 15 minutos e com a densidade celular até 3x10 7 células/ml. Variações fisiológicas do pH (6.4 à 8.4) não tiveram influência na captação de fosfato. Esse transportador de fosfato é de alta afinidade, com K0.5 = 0,087 ± 0,010 mM Pi. SCH28080 (inibidor da H+,K+ -ATPase), bafilomicina A1 (inibidor da H+ -ATPase) e FCCP (ionóforo de prótons) foram capazes de inibir o transporte de fosfato, indicando que o gradiente de prótons presente na membrana plasmática é importante para a atividade do transportador. Em adição, células crescidas em meio com baixa concentração de Pi são capazes de aumentar a expressão GdPho84, e reduzir os níveis de ATP intracelular. Esses eventos refletem num aumento da capacidade de internalizar Pi por essas células, quando comparado às células mantidas em meio controle, como em um mecanismo compensatório. O metabolismo de adenosina é capaz de modular o transporte de fosfato, indicando que outras vias são capazes de modular este transporte. Estes dados corroboram o papel essencial do Pi para o parasita.[EN] Giardia duodenalis is a flagellate protozoan that inhabits the intestine of vertebrate hosts, causing the disease known as giardiasis, which is the most common cause of diarrhea worldwide, especially in developing countries. Infection begins with the ingestion of cysts, followed by excystation and colonization of the small intestine by trophozoites, which are responsible for the clinical aspects of the disease. Like other parasites, G. duodenalis needs to perceive environmental changes to survive. Among these changes there is the availability of inorganic phosphate (Pi). Pi is an essential nutrient for all organisms because is participates in the biossynthesis of biomolecules, energy storage and formation of cellular structures. The Pi is an anionic molecule that is not able to diffuse through the membrane by simple diffusion, therefore is necessary the presence of Pi transporters in the cell membrane, which facilitate the entry of this nutrient into the cell. Pi will be later used in the cellular metabolism. The objective of the dissertation was to biochemically characterize transport of phosphate in G. duodenalis. To quantify the Pi transport, the trophozoites were grown in TYI-S-33 medium with addition of 10% fetal bovine serum at 37 °C for 48 h.Pi incorporation was measured by the rapid filtration method of living cells incubated with 32 Pi for 15 minutes. We identified a simporter Proton: Phosphate (H + :Pi) transporter type sequence (Genbank ID: GL50803_5164) in G. duodenalis, which we named GdPho84, homologous to that found in Saccharomyces cerevisiae (PHO84). Pi transport was linear up to 15 minutes and cell density to 3x10 7 cells/ml. Physiological variations of pH (6.4 to 8.4) had no influence on phosphate uptake. This phosphate transporter is of high affinity, with K0.5 = 0.087 ± 0.010 mM Pi. SCH28080 (inhibitor of H+,K+ -ATPase), bafilomicina A1 (Inhibitor of H + -ATPase) and FCCP (proton ionophore) were able to inhibit phosphate transport, indicating that the proton gradient present on the plasma membrane is important for activity. In addition, cells grown in medium with low concentration of Pi were able to increase GdPho84 expression, and reduce intracellular ATP levels. These events reflect in an increase in the capacity to internalize Pi by these cells, when compared to cells maintained in control medium, as a compensatory mechanism. Adenosine metabolism is able to modulate phosphate transport, indicating that other pathways are capable of modulating phosphate transport. These data corroborate the essential role of Pi for the parasite.