Papel do receptor P2X7 na inflamação renal induzida por sepse - Santana, Patricia Teixeira (UFRJ, 2017)
[PT] A sepse pode ser definida como a síndrome da resposta inflamatória sistêmica desencadeada por um agente infeccioso que pode resultar em choque, insuficiência de múltiplos órgãos e morte. O rim é um órgão fundamental na regulação da homeostase do organismo e pode ser diretamente afetado durante a sepse com o comprometimento da atividade renal pelo desenvolvimento de LRA. O receptor purinérgico P2X7 é ativado por ATP extracelular e leva á ativação de cascatas inflamatórias em células. O objetivo deste trabalho é investigar o papel de P2X7 receptor purinérgico na LRA induzida por sepse pelo modelo de ligadura e perfuração cecal. No presente trabalho, a sepse foi induzida por ligação e perfuração do ceco com 2 furos de 21G em animais C57BL/6 WT (WT) e P2X7 deficientes (P2X7-/-) do sexo masculino de 2 meses de idade e 24 horas mais tarde, os rins, sangue e urina foram coletados. A análise histológica comparativa dos rins foi realizada e mostrou que o receptor P2X7 participa da fisiologia renal e contribui para eventos próinflamatórios após a sepse, tais como: aumento de alargamento intersticial, perda da borda estriada,alterações glomerulares, presença de polimorfonucleares e maiores escores de lesão. Parâmetros de função renal, tais como: proteinúria urinária e UP: Cr foram analisados a partir da urina. Em macerados renais, citocinas inflamatórias IL6, IL-17, IL-1β e TNF-a foram dosados por ELISA e NO por método de Griess e observou-se que novamente o receptor P2X7 foi importante para produção de IL-1β e IL-17 e maior produção de NO. O recrutamento de células inflamatórias também foi realizado por citometria e nos animais sépticos o recrutamento de neutrófilos e linfócitos CD4+ aumenta no rim de forma dependente do receptor P2X7, sugerindo que este contribui para a manutenção do processo inflamatório no rim.A análise da produção de ROS por marcação com CM-H2DCFDA também foi avaliada e notou-se um aumento de ROS após a seps bem mais pronunciado na presença do receptor P2X7. Dada a importância da sinalicação do inflamassoma NLRP3,cujo segundo sinal de ativação pode envolver o receptor P2X7, e o aumento da produção deIL-1β a presença dos componentes do inflamassoma NLRP3, ASC e de caspase-1 foram avaliados por Western Blot e foi possível constatar que a expressão de caspase-1 embora aumenta após a sepse foi menor em animais P2X7-/-. A fim de se verificar a ativação do receptor P2X7 na célula renal ensaios com a linhagem HK-2 foram realizados. Após estímulo com LPS e ativação do receptor P2X7 com ATP extracelular as células sofreram alterações morfológicas, produziram ROS e IL-1β de forma dependente do receptor P2X7. A partir deste conjunto de dados, é possível observar que o receptor P2X7 contribui para a exacerbação da resposta inflamatória na lesão renal séptica e que este pode ser um potencial alvo terapêutico para o tratamento e controle desta enfermidade.[EN] Sepsis is defined as the systemic inflammatory response syndrome triggered by an infectious agent that can result in shock, multiple organ failure and death. The kidney is a fundamental organ in the regulation of the body's homeostasis and it can be directly affected during sepsis with impairment of renal activity by the development of AKI. The P2X7 purinergic receptor is activated by extracellular ATP and leads to the activation of inflammatory cascades in cells. The aim of this work is to investigate the role of purinergic receptor P2X7 in sepsis-induced AKI by the model of cecal ligation and perforation. In the present study, sepsis was induced by ligation and perforation of the cecum with 2 holes of 21G in C57BL/6 WT (WT) and P2X7 deficient (P2X7-/-) male animals, 2 months of age, and 24 hours later, the kidneys, blood and urine were collected. The P2X7 receptor contributes to proinflammatory events after sepsis, such as: increased interstitial enlargement, striated border loss, glomerular changes, presence of polymorphonuclear cells and higher lesion. Parameters of renal function, such as: urinary proteinuria and UP:Cr were analyzed from the urine. In renal macerates, inflammatory cytokines such as IL6, IL-17, IL-1β and TNF-a were dosed by ELISA and NO by the Griess method and it was observed that the P2X7 receptor was again important for IL-1β and IL-17 production and higher NO production. The recruitment of inflammatory cells was performed by cytometry and in septic animals, the recruitment of neutrophils and CD4 + lymphocytes increases in the kidney in a manner dependent on the P2X7 receptor, suggesting that this contributes to the maintenance of the inflammatory process in the kidney.Analysis of ROS production by CM-H2DCFDA labeling was evaluated and the increase in ROS production after sepsis was much more pronounced in WT animals.Given the importance of the signaling of NLRP3 inflammasome, the presence of NLRP3, ASC and caspase-1 inflammatory components were evaluated by Western Blot and caspase-1 expression however increased after sepsis was lower in P2X7-/- animals. In order to verify the activation of the P2X7 receptor in renal cell, assays with the HK-2 lineage were performed. After stimulation with LPS and activation of the P2X7 receptor with extracellular ATP the cells underwent morphological changes, produced ROS and IL-1β in a P2X7 receptor-dependent manner. From this data set, it is possible to observe that the P2X7 receptor contributes to the exacerbation of the inflammatory response in the septic renal injury and that this may be a potential therapeutic target for the treatment and control of this disease.