Papel do retinol e do ácido retinóico na leishmaniose cutânea : efeito na proteção da vacina intranasal LaAg - Bezerra, Izabella Pereira da Silva (UFRJ, 2016)
[PT] As leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e divididas nas formas tegumentar e visceral, contra as quais ainda não há vacinas aprovadas para o uso em humanos. Nosso grupo mostrou anteriormente que a imunização de camundongos BALB/c por vias parenterais com antígenos totais de Leishmania amazonensis (LaAg) aumenta a suscetibilidade à infecção por L. amazonensis, ao contrário da imunização por vias de mucosa, que confere proteção. Possivelmente, a proteção está associada à indução de tolerância imunológica característica de mucosas, em cujo processo o retinol (vitamina A) e seu metabólito, o ácido retinóico (AR), tem importante papel, participando da geração de células T reguladoras (Treg). No presente trabalho avaliamos a relação da proteção vacinal com tolerância imunológica e o papel do retinol da dieta na eficácia da vacina LaAg intranasal (i.n.). Para isso, camundongos BALB/c foram imunizados pela via i.n. ou subcutânea (s.c.) antes do desafio com L. amazonensis na pata. A vacina i.n., mas não a s.c., impediu a reação de hipersensibilidade cutânea mediante a infecção, indicando seu efeito tolerogênico, e aumentou, principalmente, a expressão de fatores de transcrição e citocinas Th1 (T-bet e IL-12) e Treg (Foxp3 e IL-10) nos linfonodos drenantes do sítio de infecção. Além disso, a imunização i.n. prévia impediu o efeito de exacerbação da doença pela vacina s.c.. Comprovando que o LaAg induz células nas mucosas capazes de conferir proteção na periferia, células de linfonodos cervicais (LNC) drenantes da mucosa nasal de animais imunizados pela via i.n. mostraram-se protetoras mediante transferência adotiva para camundongos infectados. A adição da proteína LACK recombinante de Leishmania ao LaAg não melhorou a eficácia vacinal e a administração do LaAg por via sublingual foi tão eficaz quanto por via i.n.Avaliamos o papel do retinol usando camundongos com suplementação de retinol da dieta (Retinol+) e com ausência (Retinol-) e observamos que animais Retinol+ imunizados pelas vias i.n. e oral apresentaram aumento de IFN- e IL-12 e redução de IL-4 nas patas infectadas, compatível com perfil Th1. Como animais Retinol+ mostraram-se mais suscetíveis à infecção, investigamos seu efeito sobre macrófagos in vitro. O tratamento de macrófagos com retinol ou AR aumentou sua infectividade à L. amazonensis e, ao mesmo tempo, sua capacidade de induzir a proliferação de linfócitos. Ademais, avaliamos o papel adjuvante do AR sobre a vacina i.n. em camundongos e em hamsters usando AR encapsulado em nanopartículas de lipídeo sólido (NLS-AR). A associação do LaAg com NLS-AR promoveu aumento da expressão das citocinas supressoras IL-10 e TGF-β nos LNC em relação ao LaAg sozinho. Além disso, a associação com NLS-AR aumentou a proteção vacinal do LaAg em hamsters contra a infecção por L. braziliensis e conferiu proteção em camundongos filhotes e jovens contra a infecção por L. amazonensis. Em conjunto, esses dados sugerem que imunização por vias de mucosa é uma boa estratégia para induzir tolerância imunológica e impedir respostas imunes periféricas indesejadas e o retinol da dieta é fundamental para este processo. Além disso, o AR poderia servir como adjuvante para vacinas tolerogênicas.[EN] Leishmaniasis are diseases caused by Leishmania parasites and are divided into tegumentary and visceral forms. Currently, there is no vaccine approved for humans. Our group has previously showed that parenteral immunization with Leishmania amazonensis total antigens (LaAg) increases BALB/c mice susceptibility to L. amazonensis infection, unlike LaAg mucosal immunization, which confers protection. Probably, this protection is associated to mucosa characteristic immune tolerance induction, wherein retinol (vitamin A) and its metabolite, retinoic acid (RA), have important role acting as a cofactor in regulatory T cell (Treg) generation. In this work, the relation between protection and immune tolerance, as well as dietary retinol effect in LaAg intranasal (i.n.) vaccine efficacy were evaluated. Thus, BALB/c mice were immunized by i.n. or subcutaneous (s.c.) route with LaAg and then challenged with L. amazonensis in the footpad. LaAg i.n., but not s.c., impaired Jones Mote hypersensitivity reaction upon infection, suggesting its tolerogenic effect, and mainly increased Th1 (T-bet and IL-12) and Treg (Foxp3 and IL-10) transcription factor and cytokine expression in lesion draining lymphnodes. Moreover, previous i.n. immunization impaired the non-protective effect of s.c. vaccine. Confirming that LaAg induces the generation of protective cells in nasal mucosa able to impair peripheral disease, adoptive transfer of cervical lymph node (CLN) cells from LaAg i.n. immunized mice controlled infection. Association with LACK recombinant protein from Leishmania not improved LaAg i.n. vaccine efficacy. LaAg was also protective by sublingual route, corroborating its tolerogenic effect.To evaluate dietary retinol role in LaAg vaccine efficacy we used retinol-supplemented (Retinol+) and deficient (Retinol-) mice and we observed that Retinol+ mice immunized with i.n. or oral LaAg increased IFN- and IL-12 and reduced IL-4 levels in infected footpads, compatible with Th1 profile. As Retinol+ mice were more susceptible to infection, we evaluated its effect on macrophages in vitro. Retinol and RA treatment increased macrophage infectivity and also its capacity to induce LaAg-responsive lymphocyte proliferation. Furthermore, we evaluated RA adjuvant role in LaAg i.n. vaccine in mice and hamsters using RA encapsulated in solid lipid nanoparticles (SLN-RA). Association with SLN-RA increased IL-10 and TGF-β expression in CLN compared to LaAg alone. Association with SLN-RA also increased LaAg protection against L. braziliensis infection in hamsters and conferred protection in newborn and young mice against L. amazonensis. Together, these data suggest that mucosal immunization could be a useful strategy to induce immune tolerance and to impair undesirable peripheral immune responses, that dietary retinol is important for this and RA might be used as a tolerogenic adjuvant.