Diferenciação cardiogênica de uma linhagem de células-tronco embrionárias e caracterização dos cardiomiócitos obtidos - Campos, Dilza Balteiro Pereira de. (UFRJ, 2015)
[PT] Introdução e objetivos: As células-tronco embrionárias (CTE) são um modelo interessante para o estudo dos mecanismos moleculares relacionados com a cardiogênese, porém as células geradas a partir de CTE não apresentam as características morfológicas, ultraestruturais e eletrofisiológicas descritas para cardiomiócitos adultos. O objetivo deste trabalho foi estudar o processo de diferenciação de uma linhagem de CTE humana em cardiomiócitos e investigar as principais características das células geradas. Método e Resultados: As CTE foram cultivadas em placa não aderente para a formação de corpos embrioides e incubadas com concentrações variáveis de BMP4, Activina A e 5ng/mL de FGF por 1, 2 ou 3 dias e em seguida foram incubadas com concentrações variáveis de XAV939 por 4 dias e após esse período, o meio de cultivo foi suplementado apenas com VEGF. No 15º dia após a agregação, o percentual de células expressando Troponina T (TnT) foi avaliado por citometria de fluxo e foram avaliadas a morfologia por imunofluorescência para TnT e α-actinina; proliferação, a expressão de canais iônicos por RT-PCR, a caracterização dos potenciais de ação pelo método do microeletrodo intracelular e as oscilações do cálcio intracelular. A incubação das CTE com BMP4 e Activina A por 72 horas resultou em um baixo percentual de células TnT+ em D15em todas as concentrações testadas das citocinas. Já a incubação com 10ng/mL de BMP4 e 6ng/mL de Activina A por 48 horas seguidas pela incubação com 10 μM de XAV 939 resultou em alto percentual de células TnT+. A fluorescência de CD56 no momento da inibição da via de Wnt possui uma correlação negativa com a eficiência de diferenciação em D15 e o percentual de células expressando baixos níveis de KDR 24h após a incubação com XAV939 guarda correlação positiva com a eficiência de diferenciação em D15.As células geradas são pequenas, com miofibrilas de organização variável e alto índice proliferativo (34,36±6,08%). Elas expressaram RNA mensageiro para todos canais iônicos responsáveis pelas principais correntes dos potenciais de ação, exceto KCND3.Foram encontrados potenciais de ação de células atriais (21%), ventriculares (60%) e nodais (19%), porém 65% dos cardiomiócitos ventriculares apresentavam despolarização espontânea. As células responderam à cafeína, aumentando o conteúdo citoplasmático de íons cálcio e a incubação com nicardipina aboliu os transientes de cálcio. Conclusão: A modulação das vias de BMP, Nodal e Wnt em CTE da linhagem hES3-Nkx 2.5GFP resultou em um alto percentual de células TnT+ 15 dias após o início da diferenciação, dependendo do momento de inibição da via de Wnt e as células apresentam propriedades eletrofisiológicas de células nodais, atriais e ventriculares, mas se assemelhando aos encontrados durante o desenvolvimento embrionário e o método de diferenciação utilizado é robusto e reprodutível.[EN] Introduction and objectives: Embryonic stem cells (ESC) are a valuable tool to study the molecular pathways involved in human cardiogenesis. ESC derived cardiomyocytes usually do not present morphological, electrophysiological and ultrastructural features of adult cardiomyocytes. Our objective was to study the process of cardiac differentiation of ESC and to investigate the main characteristics of the cardiomyocytes generated. Method and results: ESC was enzimatically and mechanically dissociated and plated in non adherent plates to generate embryoid bodies. 24 hours later, the EB were incubated with variable amounts of BMP4, Activin A and 5ng/mL of FGF for 1, 2 or 3 days. Then the cells were incubated with XAV939 for 4 days and at D15 the amount of cells expressing TnT was evaluated by flow cytometry and cardiomyocytes morphology, proliferation, mRNA expression of the main ionic currents of the cardiac action potential, action potential characterization and calcium sparks were acessed. Incubation of ESC for 72 hours did not result in a significative amount of cardiomyocytes, but the treatment of ESC with 10ng/mL of BMP4 and 6ng/mL of Activin A for 48 hours followed by incubation with 10 μM XAV 939resulted in high percentages of TnT+ cells. CD56 MIF at the moment of Wnt inhibition correlated negatively with cardiac differentiation at D15 and the percentage of cells with low expression of KDR 24 hours after Wnt inhibition also correlated with differentiation efficiency.The cells obtained at D15 were small, with variable degrees of myofibril organization and high proliferative indexes (34,36±6,08%). They expressed mRNA of the ionic channels responsible for the main currents of the action potential, except for KCND3. We found action potentials with ventricular (60%), atrial (21%) and nodal (19%) morphology but the action potentials identified as ventricular displayed phase 4 depolarization. Cells responded to caffeine increasing the amount of cytoplasmic calcium and incubation with nicardipin abolished calcium transients. Conclusion: Modulation of BMP, Wnt and Nodal pathways resulted in high percentage of TnT positive cells at D15 in hES3-Nkx 2.5 GFP cell line, but the efficiency depended on the moment of Wnt inhibition. The cells generated have electrophysiological properties of nodal, atrial and ventricular cells with a predominance of the ventricular action potential, but they resembled cells at the embryonic stages of development. The method employed was robust and reproductible.