Efeito do déficit hídrico sobre a fixação biológica de nitrogênio em feijoeiro ( Phaseolus vulgaris L.) : seleção de genótipos contrastantes e análise do transcriptoma do nódulo - Silva, Helder Anderson Pinto da (UFRJ, 2015)
[PT] O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é capaz de fixar biologicamente o N2 atmosférico através da associação simbiótica com bactérias do gênero Rhizobium. Entretanto, a fixação biológica de nitrogênio (FBN) ainda não é capaz de expressar todo o seu potencial para incrementar o rendimento da cultura. Esse quadro se dá principalmente em função da baixa capacidade de nodulação da grande maioria dos genótipos utilizados e da notável sensibilidade da simbiose a estresses abióticos tais como seca e altas temperaturas. No presente estudo, a abordagem por RNA-Seq foi empregada para identificar genes envolvidos nas respostas do nódulo ao déficit hídrico utilizando dois genótipos contrastantes de feijoeiro (susceptível e tolerante) durante a simbiose com Rhizobium tropici. Inicialmente um experimento de triagem de genótipos foi conduzido em condições de casa de vegetação a fim de avaliar a capacidade de FBN após a exposição ao déficit hídrico de quatro dias. Para tal, os acúmulos de massa seca e nitrogênio total na parte aérea (MSPA e NTAPA, respectivamente) foram avaliados dez dias após a reidratação das plantas (período de recuperação) e utilizados como marcadores fenotípicos. Após essa avaliação inicial, dois genótipos contrastantes (BAT 477 – susceptível; e Negro Argel - tolerante) foram selecionados para o experimento de RNA-Seq. Nesse experimento, a MSPA e o NTAPA foram novamente avaliados e confirmaram os resultados observados na triagem. Adicionalmente, um ensaio de redução de acetileno (ARA) foi conduzido para estimar a atividade da nitrogenase (N2ase) nos nódulos. Observou-se uma diminuição significativa da N2ase para o genótipo BAT 477 em resposta ao déficit hídrico, enquanto em Negro Argel tal efeito não foi significativo.Através da abordagem por RNA-Seq utilizando a plataforma Illumina GA/HiSeq 2000 foram obtidas 81.489.262 sequências (reads, em inglês,) para o genótipo N. Argel e 72.497.478 para BAT 477. As reads foram mapeadas no genoma referência de Phaseolus vulgaris L. e a análise da expressão diferencial utilizando os programas CuffDiff, DESeq1 e edgeR identificou 145 genes diferencialmente expressos (GDEs) (p ajustado ≤ 0.05, |log2FC| ≥ 2.0) para N. Argel e 1451 GDEs para BAT 477. Dos 145 GDEs identificados em N. Argel, apenas 47 (32,4%) genes foram induzidos enquanto 98 (67,6%) GDEs sofreram repressão nos nódulos em resposta ao estresse. Esse mesmo comportamento foi observado para BAT 477, no qual 325 (22,4%) genes foram induzidos e 1126 (77,6%) reprimidos. Embora um maior número de GDEs tenha sido observado em BAT 477, alguns grupos funcionais foram observados em ambos os genótipos, tais como proteínas de choque térmico (HSPs) (induzidas) e peroxidases (reprimidas), o que sugere a regulação de vias comuns envolvidas nas respostas do nódulo ao estresse. Além disso, a análise funcional dos GDEs usando o programa MapMan mostrou a indução de genes envolvidos nas respostas a estresses abióticos tais como HSPs e alguns fatores de transcrição (FTs) em ambos os genótipos. Por outro lado, uma notável repressão em vias relacionadas aos mecanismos antioxidantes da célula, metabolismo e sinalização hormonais, e regulação transcricional (WRKY, MYB e AP2/ERF FTs) foi observada. Por fim, a análise do perfil de expressão de 10 GDEs (PvPer22, PvRCI3, PvWRKY51, PvAp2-ERF034, PvDRFP, PvBdzp-Receptor, PvMYB41, PvWRKY56, PvRPK-LRR and PvUSP) utilizando a técnica de transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR), permitiu validar o experimento de RNA-Seq e confirmar o envolvimento desses genes nas respostas do nódulo ao déficit hídrico.Os resultados obtidos na avaliação da MSPA, NTAPA e ARA mostraram um efeito mais pronunciado do déficit hídrico no genótipo BAT 477. Tal fato justifica, parcialmente, o notável aumento no número de GDEs para esse genótipo com possíveis perturbações de diferentes vias relacionadas à aclimatação ao estresse, tais como: alterações hormonais e metabolismo antioxidante. Além disso, diversos genes com potencial de uso na manipulação da tolerância à seca em plantas, como por exemplo, HSPs e FTs, foram identificados. A caracterização funcional mais detalhada desses genes permitirá o desenvolvimento de novas estratégias para a obtenção de genótipos de feijoeiro mais tolerantes em condições de simbiose, o que poderá aumentar a contribuição da FBN para esta importante leguminosa.[EN] Common bean (Phaseolus vulgaris L.) has the ability to symbiotically fix the atmospheric nitrogen in association with Rhizobia. However, biological nitrogen fixation is still so far of its potential for this important leguminous crop. This constraint is mainly a result of low nodulation ability for the majority of common bean genotypes as well as the severe effects of environmental stresses such as drought and high temperatures on symbiosis. In the present study, we employed RNA-Seq technology to investigate the nodule transcriptome responses to drought for two common bean genotypes differing in drought tolerance during symbiosis with Rhizobium tropici. Prior to nodule transcriptome analysis, a screening experiment was carried out under greenhouse conditions to evaluate the BNF performance of thirteen common bean genotypes when submitted to four days of drought stress. To this end, we use the shoot dry weight (SDW) and shoot total nitrogen content (STNC) parameters as phenotypic markers, which were evaluated ten days after plants rehydration. Based on screening, we selected the two contrasting genotypes BAT 477 (susceptible) and Negro Argel (tolerant) for the nodule transcriptome analysis experiment. Moreover, the SDW and STNC were evaluated and confirmed the previous results. Additionally, an acetylene reduction assay (ARA) was carried out to estimate nitrogenase activity in nodules and the results corroborate the SDW and STNC which decreased for BAT 477 meanwhile it was not significantly affected for N. Argel genotype. In our RNAseq analysis, we use the Illumina GA/HiSeq 2000 platform which allowed obtaining a total of 81,489,262 and 72,497,478 high-quality reads for N. Argel and BAT 477 genotypes, respectively.The reads were mapped to the Phaseolus vulgaris L. reference genome and differential expression analysis using three different statistical algorithms (CuffDiff, DESeq1 and edgeR) identified 145 and 1451 differentially expressed genes (DEGs) (adjusted p-value ≤ 0.05, |log2FC| ≥ 2.0) for Negro Argel and BAT 477 genotypes, respectively. Among them, 47 (32.4%) were up- and 98 (67.6%) down-regulated in N. Argel nodules in response to drought. Simlar results were obtained for BAT 477, for which only 325 (22.4%) genes were up-regulated meanwhile 1126 (77.6%) were downregulated in nodules. Although a higher number of DEGs has been identified in BAT 477 nodules, some common shared genes were drought-regulated for both genotypes, which include a heat shock protein (HSP) (up-regulated) and a peroxidase family protein (downregulated), suggesting the recruitment of similar pathways in response to drought. Moreover, functional analysis on MapMan software showed the induction of genes involved in abiotic stress responses such as HSPs and some transcription factors (TF) for both genotypes. On the other hand, a remarkable down-regulation in metabolic pathways related to antioxidant protection, hormone signalling and metabolism, and transcriptional regulation (WRKY, MYB and AP2/ERF TFs) was also observed. Furthermore, reverse transcription–quantitative PCR (RT-qPCR) analyses confirm the expression profile of up- and down-regulated DEGs belonging to different functional categories (PvPer22, PvRCI3, PvWRKY51, PvAp2-ERF034, PvDRFP, PvBdzp-Receptor, PvMYB41, PvWRKY56, PvRPK-LRR and PvUSP) which indicates that these genes are functionally associated to drought stress responses in nodules.As a conclusion, similar to SDW, STNC and ARA analyses, a more pronounced effect of drought was observed on BAT 477 genotype which showed a higher number of DEGs and down-regulation, and probably disturbances, in several pathways related to stress acclimation such as hormone and antioxidant metabolism. Moreover, some genes used for droughttolerance manipulation in crop species such as HSPs and key TFs were found. Deciphering the complex transcriptional regulation in nodules under stress might provide new strategies to manipulate the drought tolerance in common bean for future improvement of BNF contribution in this important leguminous crop.