O papel dos genes homólogos a tonB, exbB, exbD1 e exbD2 no transporte de ferro em Gluconacetobacter diazotrophicus estirpe PAL5T - Soares, Cleiton de Paula (UFRJ, 2014)
[PT] Gluconacetobacter diazotrophicus é uma bacteria endofítica fixadora de nitrogênio originalmente isolada de plantas de cana-de-açucar. O ferro é um micronutriente essencial para as plantas e bactérias. O complexo TonB–ExbB–ExbD é responsável pela captação de ferro e substâncias como vitamina B12 em várias espécies de bactérias. O objetivo deste estudo foi caracterizar geneticamente um mutante de G. diazotrophicus que possui um transposon Tn5 inserido na região promotora de um gene homologo a tonB e investigar o papel dos genes tonB, exbB, exbD1 exbD2, e fur no transporte e metabolismo de ferro. Este mutante, designado Gdiaa31, mostrou redução na taxa de crescimento e baixa resposta ao ferro disponível quando comparado a estirpe selvagem PAL5T. Inúmeras tentativas de gerar mutantes nulos para os genes tonB, exbB, exbD1 exbD2, e fur, por meio da inserção de um transposon Tn5, não tiveram sucesso. Análises de qPCR mostraram a redução da transcrição de tonB no mutante Gdiaa31 quando comparado a estirpe selvagem. Em comparação a PAL5T, Gdiaa31 também mostrou redução na atividade da nitrogenase e formação de biofilme. Adicionalmente, Gdiaa31 acumulou altos níveis de sideróforos no sobrenadante. A complementação genética de Gdiaa31 com plasmídeo contendo o gene tonB e sua região promotora (pPtonB) restaurou os fenótipos relacionados a atividade da nitrogenase e o acumulo de sideróforos.Também foi observado que fur está envolvido na homeostase de ferro em G. diazotrophicus. Estes resultados indicam que o complexo TonB tem um importante papel no transporte de ferro/sideróforos e pode ser essencial na fisiologia de G. diazotrophicus.[EN] Gluconacetobacter diazotrophicus is an endophytic nitrogen-fixing bacterium, which was originally isolated from the interior of sugarcane plants. Iron is an essential micronutrient for plants and bacteria. TonB–ExbB–ExbD protein complex is responsible for the uptake of iron and substances such as vitamin B12 in several bacterial species. The aim of this study was to genetically characterize a G. diazotrophicus mutant carrying a Tn5 insertion in the promoter region of a tonB gene homologue and to investigate the role of genes tonB, exbB, exbD1 exbD2, and fur in transporter and iron metabolism. This mutant, named Gdiaa31, displayed a reduced growth rate and a lack of response to iron availability when compared to the wildtype strain PAL5T. Several efforts to generate null-mutants for the tonB gene by insertional mutagenesis were without success. qPCR analysis demonstrated reduced transcription of tonB in Gdiaa31 when compared to PAL5T. In comparison to PAL5T, Gdiaa31 also demonstrated decreased nitrogenase activity and biofilm formation capability. Additionally, Gdiaa31 accumulated higher siderophore levels in culture supernatant. The genetic complementation of the Gdiaa31 strain with a plasmid that carried the tonB gene including its putative promoter region (pPtonB) restored nitrogenase activity and siderophore accumulation phenotypes. It was also observed that fur is involved in iron homeostasis in G. diazotrophicus. These results indicate that the TonB complex has a role in iron/siderophore transport and may be essential in the physiology of G. diazotrophicus.