Regulação da eosinopoiese em modelo de asma alérgica : papel dos glicocorticóides endógenos da tolerância oral e da via da 5-lipoxigenase - Brito, Daniela Masid de (UFRJ, 2014)
[PT] Nosso grupo mostrou anteriormente que: a) a dexametasona e o leucotrieno(LT)D4 aumentam a produção de eosinófilos (eosinopoiese) em medula óssea de doadores BALB/c naive, cultivada com Interleucina (IL)-5, mimetizando os efeitos da provocação alergênica observados em animais sensibilizados; b) o trauma cirúrgico aumenta, por mecanismos de estresse, a resposta à IL-5, mimetizando o priming encontrado após sensibilização/provocação; c) a tolerização oral à ovalbumina inibe a resposta eosinopoiética à sensibilização e provocação subsequentes; d) a dietilcarbamazina (DEC), que bloqueia eficazmente a produção de leucotrienos, suprime a eosinopoiese em animais imunizados e provocados. Essas observações sugerem que os glicocorticoides e os produtos da via da 5-lipoxigenase (5-LO) contribuem para a resposta eosinopoiética à provocação alergênica, e evidenciam novos mecanismos patogenéticos e terapêuticos na inflamação pulmonar alérgica. Neste estudo, avaliamos esses mecanismos, focalizando sucessivamente o papel dos glicocorticoides adrenais na resposta hematológica à sensibilização/provocação, o impacto da tolerização oral sobre a medula óssea, e a relação entre a 5-LO e os mecanismos de eosinofilia e de resposta terapêutica à DEC. Para isto, utilizamos camundongos isogênicos de tipo selvagem (BALB/c, C57BL/6, B6.129 e PAS) e mutantes deficientes em receptores de TNF- de tipo I (TNFR-KO) ou em 5-LO (ALOX). Quantificamos eosinófilos na medula óssea recém-coletada (dia 0, indicando eosinopoiese in vivo) ou cultivada 7 dias com IL-5 (dia 7, indicando eosinopoiese ex vivo), ou no lavado peritoneal, e realizamos dosagens de corticosterona plasmática. Onde indicado, utilizamos: a) inibidores da produção (metirapone) e da atuação dos glicocorticoides (mifepristone, RU486), ou da produção de leucotrienos (DEC, MK886); b) tolerização oral com OVA antes da sensibilização.O aumento do número de eosinófilos na medula óssea, resultante da provocação alergênica em camundongos sensibilizados de tipo selvagem, foi abolido por: a) tratamentos com RU486, metirapone, ou anticorpos neutralizantes anti-TNF-; b) tratamentos com MK-886 e DEC; c) indução de tolerância oral, ou transferência de linfócitos T esplênicos de doador singênico previamente tolerizado, sensibilizado e provocado com OVA. Em camundongos mutantes, ALOX ou TNFR-KO, não houve aumento da eosinopoiese in vivo após sensibilização/provocação. Os níveis de corticosterona aumentaram em animais sensibilizados/provocados de tipo selvagem (mas não em TNFR-KO), sendo o aumento bloqueado pelo metirapone. O bloqueio da resposta eosinopoiética em camundongos tratados com RU486 foi acompanhado de redução significativa do acúmulo de eosinófilos na cavidade peritoneal, mostrando um papel inédito para os glicocorticoides endógenos na promoção da inflamação alérgica. Já em camundongos ALOX sensibilizados e provocados, houve redução importante da migração de eosinófilos para a cavidade peritoneal em resposta à provocação. A DEC foi ineficaz em camundongos ALOX, como esperado para um mecanismo de ação dependente da via da 5-LO. Em conjunto, os dados mostram um importante papel dos glicocorticoides endógenos, da tolerância oral e da 5-LO na regulação da eosinopoiese em diferentes modelos de inflamação alérgica, sendo os efeitos dos glicocorticoides endógenos dependentes da sinalização por TNF-α, e tanto a resposta à provocação alergênica como a eficácia da DEC dependentes de 5-lipoxigenase. Finalmente, os efeitos da tolerização oral evidenciam um papel inédito de linfócitos T alergeno-específicos na regulação da granulopoiese.[EN] Our group previously showed that: a) dexamethasone and leukotriene(LT)D4 enhance eosinophil production (eosinopoiesis) from bone-marrow of naive BALB/c donors, cultured with IL-5, reproducing the effects of allergen challenge in sensitized mice; b) surgical trauma increases, through stress mechanisms, the response to IL-5, reproducing the priming effect observed in sensitized/challenged mice; c) oral tolerization to ovalbumin inhibits the eosinopoietic response to further sensitization and challenge; d) diethylcarbamazine (DEC), which effectively blocks leukotriene production, suppresses eosinopoiesis in sensitized/challenged mice. Together, these observations suggest that glucocorticoids and 5-lipoxygenase (5-LO) products contribute to the eosinopoietic response to allergen challenge, and provide evidence of novel pathogenetic and therapeutic mechanisms in allergic pulmonary inflammation. We have here explored these mechanisms, successively focusing on the role of adrenal glucocorticoids in the bone-marrow response to sensitization/challenge, the impact of oral tolerance on bone-marrow, and the relationship between 5-LO and the mechanisms of eosinophilia and therapy with DEC. We used inbred wild-type mouse strains (BALB/c, C57BL/6, B6.129 and PAS) and mutants lacking type I TNF- receptors (TNFR-KO) or 5-LO (ALOX). We quantified eosinophil numbers in bone-marrow, freshly harvested (day 0, reflecting in vivo eosinopoiesis) or cultured for 7 days with IL-5 (day 7, reflecting ex vivo eosinopoiesis), or in peritoneal lavage fluid, as well as plasma corticosterone.Where indicated, we used: a) inhibitors of the production (metyrapone) and receptor-binding of glucocorticoids (mifepristone, RU486), or of leukotriene generation (DEC, MK886); b) oral tolerance induction before sensitization. The increase in eosinophil numbers in bone-marrow, induced by allergen challenge in sensitized wild-type mice, was abolished by: a) pretreatment with RU486, metyrapone, or anti-TNF-neutralizing antibody; b) pretreatment with MK-886 and DEC; c) induction of oral tolerance, or transfer of T cells from a syngeneic donor previously tolerized, sensitized and challenged. In ALOX or TNFR-KO mutants, there was no increase in eosinopoiesis following sensitization and challenge. Plasma corticosterone was increased in sensitized/challenged wild-type (but not TNFR-KO) mice, and the increase was abolished by metyrapone. Blockade of the eosinopoietic response in RU486-treated mice was accompanied by a significant reduction in eosinophil accumulation in the peritoneal cavity, demonstrating a novel role for endogenous glucocorticoids in promoting allergic inflammation. In sensitized/challenged ALOX mice, challenge-induced migration of eosinophils to the peritoneal cavity was significantly reduced. DEC was ineffective in ALOX mice, as expected from a mechanism of action dependent on 5-LO. Overal, the data document important roles for endogenous glucocorticoids, oral tolerance and 5-LO in regulating eosinopoiesis in various models of allergic inflammation, with a requirement for TNF- signaling in glucocorticoid actions, and for 5-LO both in sensitization/challenge and DEC antiallergic effects. Finally, the effects of oral tolerance highlight a novel role for allergen-specific T cells in regulation of granulopoiesis.