Engenharia evolutiva e metabólica de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a eficiência da fermentação de misturas contendo hexoses e pentoses - Vilela, Leonardo de Figueiredo (UFRJ, 2014)
[PT] A produção de bioetanol a partir da fermentação de hidrolisado proveniente de material lignocelulósico é de grande importância tanto em termos econômicos como em termos ambientais. Cepas industriais de Saccharomyces cerevisiae prontamente fermentam as hexoses contidas nos materiais hidrolisados, tais como a glicose e a frutose, levando a produção de etanol. Porém, tal levedura é incapaz de fermentar xilose (pentose advinda da porção hemicelulósica do material hidrolisado), que responde por cerca de 20% do total de açúcares presentes no hidrolisado do bagaço de cana-de-açúcar. Para aumentar o rendimento obtido na fermentação de hidrolisados de materiais lignocelulósicos, um dos procedimentos é a otimização das cepas por engenharia metabólica. Neste trabalho realizou-se a clonagem e a expressão do gene xylA, que codifica xilose isomerase (XI), de Burkholderia cenocepacia em S. cerevisiae. A XI recombinante apresentou alta atividade e possibilitou a levedura geneticamente modificada fermentar a xilose anaerobicamente, sem acúmulo de xilitol, em um meio que continha uma mistura de glicose e xilose semelhante ao encontrado nos hidrolisados de bagaço de cana. A inserção de xylA causou um aumento de 5 vezes no consumo de xilose (0,5 X 2,5 g xilose/L) e um aumento de 1,5 vezes na produção de etanol (4,2 X 7,8 g etanol/L), em 24h de fermentação. No entanto, a levedura recombinante fermentou a xilose lentamente. Para melhorar a perfomance fermentativa, uma estratégia de engenharia evolutiva foi aplicada para melhorar a fermentação de xilose pela levedura expressando xylA. Este processo envolveu cultivos sequencias em xilose.A linhagem de levedura resultante deste processo apresentou rápida co-fermentação de glicose e xilose, quase simultaneamente, exibindo melhora significativa no consumo específico de xilose (cerca de 10 vezes – 0,08 X 0,6 g/L/h), glicose (cerca de 2 vezes – 0,48 X 0,73 g/L/h) e produtividade de etanol (0,19 X 0,42 g etanol/g cel/h) comparada a cepa não adaptada. Além disso, células cultivadas em meio contendo concentrações elevadas de glicose, antes da transferência para o meio de fermentação, mostraram maiores taxas de consumo de xilose comparada a células cultivadas em xilose somente, tanto na cepa adaptada (0,49 X 0,6 g/L/h) quanto na cepa não adaptada (0,05 X 0,08 g/L/h), sugerindo que a utilização da xilose não estava sendo regulada por repressão catabólica. Resultados obtidos por PCR em tempo real sugeriram que a eficiência na fermentação da xilose mostrada pela cepa adaptada em xilose deve ser atribuída, pelo menos em parte, ao aumento da expressão dos genes HXT2 (cerca de 1,3 vezes) e TAL1 (cerca de 3 vezes), que codificam um transportador de hexose de baixa afinidade e a enzima transaldolase, respectivamente. A produtividade do etanol obtida depois da introdução de uma única modificação genética e da submissão de uma estratégia de engenharia evolutiva foi equivalente à de cepas submetidas a uma extensa engenharia metabólica e evolutiva.[EN] Ethanol production from the fermentation of hydrolysates derived from lignocellulosic material is of great importance both economically and environmentally. Industrial strains of Saccharomyces cerevisiae readily ferment hexoses present in the hydrolysate materials, such as glucose and fructose, in order to produce ethanol. However this yeast is unable to ferment xylose (a pentose arising from the hemicellulose portion of the hyldrolyzed material) which accounts for about 20% of total sugars presents in hydrolysates of sugarcane bagasse. To increase the fermentation yield of lignocellulosic hydrolysates is necessary that industrial strains be optimized by metabolic engineering. This study presents results regarding the successful cloning of the bacterial xylose isomerase gene (xylA) of Burkholderia cenocepacia and its functional expression in Saccharomyces cerevisiae. The heterologous expression of the gene xylA enabled a laboratorial yeast strain to ferment xylose anaerobically, without accumulation of xylitol, in medium containing a glucose–xylose blend similar to that found in sugar cane bagasse hydrolysates. The insertion of xylA caused a 5-fold increase in xylose consumption (0,5 X 2,5 g xilose/L), and over a 1.5-fold increase in ethanol production and yield, in comparison to that showed by the WT strain (4,2 X 7,8 g etanol/L), in 24 h fermentations. However, the recombinant yeast fermented xylose slowly. An evolutionary engineering strategy was applied to improve xylose fermentation by the xylA-expressing yeast strain, which involved sequential batch cultivation on xylose.The resulting yeast strain co-fermented glucose and xylose rapidly and almost simultaneously, the evolved strain showed an overall expressive higher xylose consumption (around 10-fold higher - 0,08 X 0,6 g/L/h) glucose (around 2-fold higher - 0,48 X 0,73 g/L/h) exhibiting improved ethanol productivity (0,19 X 0,42 g etanol/g cel/h). It was also observed that when cells were grown in a medium containing higher glucose concentrations before being transferred to fermentation medium compared to cells grown on xylose only, both in the adapted strain (0.49 X 0.6 g / L / h) as the non-adapted strain (0.05 X 0.08 g / L / h), higher rates of xylose consumption were obtained, suggested that xylose utilization was not regulated by catabolic repression. Results obtained by real time PCR suggested that the efficiency in xylose fermentation showed by the adapted xylose strain should be attributed, at least in part, to the increase in the expression of HXT2 (around 1,3-fold higher) and TAL1(around 3-fold higher), which code for a low affinity hexose transporter and transaldolase, respectively. The ethanol productivity obtained after the introduction of only one genetic modification and the submission one-stage process of evolutionary engineering was equivalent to strains submitted to extensive metabolic and evolutionary engineering.