Engenharia Metabólica e caracterização das vias biossintéticas e regulatórias da produção de Raminolipídeos em Burkholderia kururiensis - Silva, Patrícia Martins da. (UFRJ, 2012)
[PT] O objetivo inicial deste trabalho foi a utilização da cepa Burkholderia kururiensis KP23T como hospedeiro heterólogo na produção de biossurfactantes do tipo raminolipídeo, através da expressão de genes oriundos de Pseudomonas aeruginosa (PAO1). Foram selecionados três clusters gênicos para obtenção de cepas super-produtoras. Dentre todas as construções feitas, a cepa LMM21, que expressa os genes rhlA e rhlB de P. aeruginosa, foi a que mais se destacou. Em termos de rendimento, um total de 839 g/mL de raminolipídeos foi obtido após 24 horas de incubação em meio otimizado, e um percentual de emulsificação de 53%. Um homólogo ao gene rhlA, designado rhlABK, foi clonado e sequenciado a partir da cepa B. kururiensis (M130), demostrando um percentual de similaridade de 16% quando a sequência protéica foi comparada com P. aeruginosa para os 334 aminoácidos deduzidos. Um mutante foi produzido através de deleção/inserção do gene rhlA, produzindo fenótipos envolvidos na produção de biofilmes, motilidade celular e formação de matriz extracelular. Outro aspecto abordado durante o desenvolvimento do projeto foi a análise dos fenótipos regulados pelo sistema BraR/BraI para melhor elucidar o sistema de comunicação intercelular quorum sensing em B. kururiensis. Os resultados indicaram que este sistema regulatório participa da expressão de genes envolvidos na mobilidade celular, produção de raminolipídeos produzidos pela própria B. kururiensis assim como na formação de biofilmes aderentes. Ensaios específicos sugerem que B. kururiensis (M130) apresenta um segundo gene regulatório de quorum sensing, denominado rhlRBK, que ativa especificamente o gene rhlABK. Dados preliminares indicam que, possivelmente, estes sistemas não participam da ativação de genes envolvidos na degradação de compostos tóxicos, como tricloroetileno (TCE) por Burkholderia kururiensis M130.[EN] This study was focused on Burkholderia kururiensis KP23T as a biosurfactant producer. Overexpression of biosynthetic rhamnolipid genes from Pseudomonas aeruginosa was the strategy of metabolic engineering. Three gene clusters were selected to obtain modified strains with improved ability to produce biosurfactant. Of all constructs, strain LMM21 was the one that stood out, giving a total production of 839 g/mL rhaminolipids after 24 hours of incubation and a percentage of emulsification of 53%. An rhlABK homologous gene was cloned and sequenced from B. kururiensis M130, and showed a similarity percentage of 16% when compared to P. aeruginosa, over the 334 predicted amino acids. We created a mutant strain by insertion/deletion that resulted in some phenotypes involved in biofilm production, cell motility and extracellular matrix secretion. Another issue addressed during the development of the project was the analysis of phenotypes regulated by the BraI/BraR quorum sensing intercellular system communication. The results indicated that this regulatory system participates in the activation of genes involved in cell motility, and rhamnolipid production by B. kururiensis, as well as the formation of adherent biofilms. Specific tests suggest that B. kururiensis (M130) presents a secondary regulatory system, designated rhlRBK that seems to specifically activate the gene rhlABK. Preliminary data indicate that perhaps this system does not play a role in the activation of genes involved in degradation of toxic compounds such as trichloroethilene (TCE) by B. kururiensis M130.