Modulação da fagocitose mediada por receptor Fcγ via receptores Toll-like : participação de produtos da 5-lipoxigenase - Pinheiro, Carla da Silva (UFRJ, 2011)
[PT] Os receptores Toll-like (TLRs) são receptores que reconhecem padrões moleculares presentes nos microrganismos. Após reconhecimento, os microorganismos são englobados através do processo de fagocitose. Os leucotrineos (LTs), metabólitos da via da 5-lipoxigenase (5-LO), aumentam a fagocitose Fcγ dependente. Neste estudo, avaliamos o papel dos agonistas de TLR2, 3, 4 e 9, durante a fagocitose mediada por Fcγ. Investigamos também um possível envolvimento dos LTs neste processo. Observamos que o pré-tratamento com os agonistas de TLR2, 3 e 4, mas não TLR9, seguido do desafio com eritrócitos de carneiro opsonizado (IgG-sRBC) aumentou a fagocitose em macrófagos alveolares (MA). Este fenômeno mostrou-se dose-dependente para os agonistas de TLR2 e 3, mas não para o TLR4. Surpreendentemente, a fagocitose foi amplificada em curto período de tratamento com agonistas de TLR2 e TLR4. Contudo, a amplificação da fagocitose induzida pelo ligante de TLR3 foi um evento tempo-dependente, sendo observada a partir de 30 min de pré-tratamento. Além disso, este aumento da fagocitose foi observado em outras populações de macrófagos (macrófagos peritoneais -MP- e macrófagos derivados de medula – BMDM) sugerindo um fenômeno universal. Para avaliar a participação da via da 5-LO, MA foram previamente incubados com zileuton e MK886, inibidores da 5-LO e da enzima ativadora da 5-LO (FLAP), respectivamente. A inibição da 5-LO impediu a amplificação da fagocitose, sugerindo a participação dos LTs neste processo. Este resultadotambém foi observado em MP e BMDMs. Para ratificar o dado farmacológico, MPs e BMDMs de camundongos 5-LO-/- foram incubados com agonistas de TLRs e desafiados com IgG-sRBC. A fagocitose foi reduzida em células 5-LO-/- quando comparado ao controle. Em seguida, investigamos possíveis mecanismos moleculares capazes de contribuir para amplificação da fagocitose.Exceto para o TLR4, as cinases P42/P44 e P38, apresentaram amplificação da ativação com o pré-tratamento com ligantes de TLRs, seguida da adição de IgG-sRBC. A inibição farmacológica da via de P42/P44 com PD98059 reduziu a amplificação da fagocitose. Demonstramos também que o estímulo com os ligantes de TLRs resultou em reorganização dos filamentos de actina. Uma vez que a inibição da via da 5-LO diminui a fagocitose foi investigado quais LTs seriam produzidos durante este processo. A produção de LTB4 induzida pela interação com a IgG foi amplificada pelos ligantes de TLR2 e TLR4, mas não pelo TLR3. Resultado semelhante foi obtido para os cis-LTs, cuja produção foi aumentada pelo TLR2 e TLR4 após desafio com IgG-sRBC. A imunolocalização da 5-LO foi detectada ao redor da membrana dos fagossomos e não nos corpúsculos lipídicos. Juntos, estes resultados indicam que os ligantes de TLRs amplificam a fagocitose FcγR-dependente, com a participação de produtos da 5-LO.[EN] Toll-like receptors (TLRs) are members of pattern recognition receptors which recognize a broad spectrum of molecules present in microorganisms. Once recognized, microorganisms are engulfed trough phagocytosis. Leukotrienes (LTs), lipid mediators produced by 5- lipoxygenase (5-LO) pathway, are able to increase FcγR mediated phagocytosis. In our study we sought to evaluate the role of TLR2, 3, 4, and 9 agonists during FcγR-mediated phagocytosis, and a possible involvement of LTs. Herein, we observed that alveolar macrophages (AM) pre-treated with TLR2, 3, and 4 agonists, but not TLR9, followed by sheep red blood cells opsonized (IgG-sRBC) challenge, resulted in a great increase in phagocytosis. When a dose-response curve was performed, it was noticed a concentrationdependent phenomenon. Surprisingly, phagocytosis was amplified by short term treatment with TLR2, and 4 agonists. In contrast, phagocytosis amplification induced by TLR3 ligand was a time-dependent event, been observed 30 min after IgG-sRBC challenge. Moreover, the enhancement in phagocytic process evoked by TLRs ligands shown in AM was also observed in other cell types analyzed (thioglycolate elicited peritoneal macrophages (PM) and bone marrow derived macrophage - BMDM) suggesting a universal phenomenon. In order to evaluate 5-LO products participation, AM were pre-incubated with 5-LO and 5-lipoxygenase activating protein inhibitors, before TLRs stimulation. 5-LO inhibition impaired TLRs ligandinduced phagocytosis amplification, suggesting the participation of LTs. This result was also noticed in PM and BMDMs. To confirm our pharmacological data, PM and BMDMs from 5- LO-/- mice were used and phagocytosis was reduced in 5-LO-/- cells. Next we investigate possible molecular mechanisms which could contribute to phagocytosis amplification.P42/P44 and P38, mitogen-activated protein kinase (MAPKs) were phosphorilated under TLR2 and 4 agonists stimulation. Except for TLR4, this activation was exacerbated under IgG-sRBC treatment. The inhibition of P42/P44 activation was able to reduce the phagocytosis amplification mediated by TLRs. We also demonstrate that under TLRs stimulation there was actin filaments reorganization when compared to control group. Since 5-LO pathway was implicated, leukotriene B4 (LTB4) and cysteinil leukotrienes (cys-LTs) were measured. LTB4 production induced by IgG engagement was amplified by TLR2 and TLR4 ligands, but not by TLR3. Similar results were obtained for cis-LT, whose production was increased by TLR2 and TLR4 followed by IgG-sRBC challenge. 5-LO imunolocalization was detected around phagossome membrane and not in lipid bodies. Together, these data indicate that TLR ligands amplify phagocytosis suggesting a possible interaction between FcγR and TLR signaling pathway with 5-LO products participation.