Produção e aplicação de lipase no desenvolvimento de um biossensor potenciométrico - Melo, Ariana Farias. (UFRJ, 2012)
[PT] O uso de enzimas para fins analíticos vem aumentando, principalmente no ramo da biotecnologia associado à criação de novos instrumentos de análises cada vez mais específicos. Como consequência, o desenvolvimento de biossensores vem crescendo, já que estes permitem que a medida do analito de interesse seja realizada pela transdução seletiva de um parâmetro da reação biocomponente-analito em um sinal elétrico passível de ser monitorado. Enquanto os métodos clássicos são geralmente laboriosos ou exigem um pré- tratamento da amostra, os biossensores oferecem o recurso de detecção em linha de um analito com mínimo tratamento da amostra. Além disso, por haver a presença de um biocomponente, os biossensores são específicos para um dado analito, proporcionando respostas rápidas e gerando menos resíduos para o meio ambiente, ao contrário do métodos tradicionais. Nesta tese, a enzima lipase foi escolhida como biocomponente para a construção de um biossensor. Essa escolha foi realizada em função da característica que essa enzima possui, como fornecer respostas rápidas, sua especificidade e a possibilidade de ser imobilizada em um suporte vítreo atendendo as exigências para composição de um biossensor. O transdutor que compõe os biossensores pode ser amperométrico, potenciométrico, óptico ou calorimétrico.No presente trabalho, foi utilizado um transdutor potenciométrico, com o objetivo de quantificar o produto gerado da reação da lipase em amostras de biodiesel. A enzima lipase foi selecionada para ser aplicada no biossensor desenvolvido, pois é capaz de hidrolisar triglicerídeos (ésteres) liberando ácidos graxos livres e íons H+ , como produto da reação, que podem ser quantificados e a qualidade do biodiesel pode ser certificada. No trabalho foram utilizados dois extratos enzimáticos, sendo um de Aspegillus niger e o outro de Yarrowia lipolítica, e lipase comercial tipo VII obtida a partir de Candida rugosa da marca Sigma. viii Para avaliar a eficiência das lipase selecionadas foram realizados ensaios de determinação da atividade hidrolítica em amostras de biodiesel, bem como em óleos vegetais usados na sua produção, em conjunto com o eletrodo de pH, utilizado como transdutor. A lipase comercial foi testada na forma livre e imobilizada em pérolas de vidro. Os resultados obtidos com a lipase comercial apresentaram um melhor desempenho para a construção do biossensor. O sistema (lipase comercial / eletrodo) apresentou respostas com 15 min a pH 8,75 e 37 ºC. A corrente (mV) produzida foi proporção à concentração de amostra (350-17.500 mM de ácido graxo livre). Uma boa correlação (R2 = 0,9285) foi encontrada mostrando um bom desempenho para a detecção potenciométrica de ésteres/triglicerídeos em óleos e biodiesel. Portanto, um novo método potenciométrico foi desenvolvido e validado para a determinação da degradação de amostras de biodiesel empregando biossensor enzimático potenciométrico, para ser aplicado no Monitoramento da Qualidade de Biodiesel.[EN] The use of enzymes for analytical purposes is increasing, mainly in the field of biotechnology associated with the design of new analytical tools even more specific. Thus, the development of biosensors has increased, since they allow the measurement of the desired analyte to be carried by the selective transduction of a biocomponent-analyte reaction parameter to an electrical signal that can be monitored. While the traditional methods are usually time consuming and require a pretreatment of the sample, the use of biosensors provides on-line detection of an analyte with minimal sample treatment. Furthermore, due to the presence of a biocomponent, biosensors are specific to a given analyte, allowing quick responses and generating less waste to the environment, unlike the traditional methods. In this work, the enzyme lipase was chosen as the biocomponent for the design of a new biosensor due to its attractive features such as specificity, to provide rapid responses, and to the possibility of being immobilized on a support glass that meets the requirements for the composition of a biosensor. The biosensor transducer can be amperometric, potentiometric, optical or calorimetric. In this study, we used a potentiometric transducer, in order to quantify the product generated from the reaction of lipase in biodiesel samples.The lipase enzyme was selected for the biosensor because it can hydrolyze triglycerides (esters) releasing free fatty acids and H+ ions, as the reaction products, which can be quantified and the quality of biodiesel can be certified. Two enzymatic extracts were utilized, Aspergillus niger and Yarrowia lipolytica , and also free and immobilized lipase type VII derived from Candida rugosa by Sigma. The efficiency of the lipase selected was assessed by performed experimental essays to determine the hydrolytic activity in samples of biodiesel, as well as in the vegetable oils used in its production, using pH electrode as a transducer. The commercial lipase x was tested in the free and immobilized form onto glass beads. The results obtained with the commercial lipase performed better for the design of the biosensor. The system (commercial lipase / electrode) showed responses to 15 min at pH 8.75 and 37 °C. The current (mV) generated was proportional to the concentration of the sample (350-17500 mM free fatty acid). A good correlation (R2 = 0,9285) was found showing a good performance for the potentiometric detection of esters / triglycerides in oils and biodiesel. A new potentiometric method was developed for determining the degradation of samples of biodiesel employing an enzymatic potentiometric biosensor for Monitoring the Quality of Biodiesel.