Disfunção sináptica e comprometimento do transporte axonal induzidos por oligômeros do peptídeo β-amilóide - Decker, Helena (UFRJ, 2010)
[PT] Oligômeros solúveis do peptídeo β-amilóide (AβOs), as principais neurotoxinas responsáveis pela patologia da Doença de Alzheimer (DA), se acumulam no cérebro de pacientes acometidos pela DA e se ligam seletivamente a terminais sinápticos excitatórios, o que desencadeia a falência sináptica. A identidade do receptor específico destes oligômeros ainda permanece desconhecida. Como os AβOs interferem com a função dos receptores glutamatérgicos do subtipo N-metil-Daspartato (NMDAR), nós formulamos a hipótese de que a presença dos NMDARs é requerida para a ligação sináptica dos AβOs. Para investigar esta hipótese, foram utilizados vetores amplicon para silenciar os NMDARs em neurônios hipocampais em cultura. Este procedimento reduziu em cerca de 90% a expressão dendrítica de NMDARs e bloqueou o estresse oxidativo induzido por AβOs. De forma impressionante, o silenciamento de NMDARs aboliu a ligação de AβOs às sinapses. Entretanto, estes oligômeros não se ligam diretamente aos NMDARs, já que o tratamento com insulina, que induz a redução da expressão de sítios de ligação dos AβOs, não provoca a redução dos níveis de NMDARs na superfície neuronal. A identificação de NMDARs como componente-chave do complexo receptor da ligação de AβOs pode contribuir para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas para prevenir a falência sináptica induzida por AβOs. Outro aspecto da disfunção neuronal investigado neste trabalho diz respeito ao efeito dos AβOs no transporte axonal, fundamental para a comunicação e sobrevivência neuronal. Já está bastante estabelecido que o comprometimento do transporte axonal é uma característica inicial em várias doenças neurodegenerativas, incluindo DA, porém os mecanismos responsáveis ainda são pouco conhecidos.Através de imageamento em tempo real, nós observamos que AβOs induzem o comprometimento do transporte de vesículas secretórias densas (DCVs) e mitocôndrias em neurônios hipocampais em cultura. Antagonistas de NMDAR, incluindo D-AP5, MK801 e memantina, preveniram o déficit no transporte induzido por AβOs, identificando o NMDAR como um participante inicial deste mecanismo, ainda na membrana celular. Tanto a inibição farmacológica quanto a expressão de uma forma dominante negativa da proteína quinase glicogênio sintase -3β (GSK-3β) preveniram o comprometimento no transporte induzido por AβOs. Além disso, foi demonstrado, através de técnicas bioquímicas e imunocitoquímicas, que os AβOs não afetam a estabilidade e integridade dos microtúbulos (MTs), indicando que AβOs comprometem o transporte axonal por um mecanismo mais sutil do que a desintegração dos MTs, como, por exemplo, a desregulação de vias de sinalização intracelular. Estes resultados demonstram que os AβOs afetam o transporte axonal negativamente por um mecanismo iniciado por NMDARs e mediado por GSK-3β e estabelece uma nova conexão entre AβOs e a patologia da DA.[EN] Soluble oligomers of the amyloid-β peptide (AβOs), increasingly recognized as the main neurotoxins in Alzheimer’s disease (AD) pathology, accumulate in AD brains and target excitatory post-synaptic terminals. This is thought to trigger synapse deterioration, a mechanism possibly underlying AD memory loss. A major unknown is the identity of the receptor(s) targeted by oligomers. Because oligomers interfere with N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) function, we hypothesized that NMDARs might be required for oligomer binding to synapses. An amplicon vector was used to knock-down NMDARs in mature hippocampal neuronal cultures, yielding 90% reduction in dendritic NMDAR expression and blocking oligomer-induced neuronal oxidative stress. Remarkably, NMDAR knock-down abolished oligomer binding to synapses. Nevertheless, oligomers do not directly bind to NMDARs, since insulin, which has been shown to down-regulate oligomer-binding sites, did not cause NMDAR down-regulation. Establishing that NMDARs are key components of the synaptic oligomer binding complex may illuminate the development of novel approaches to prevent synapse failure triggered by AβΟs. Another issue investigated in this study is the effect of AβOs on axonal transport of organelles, a neuronal function crucial to communication and survival. Disruption of axonal transport is a hallmark of several neurodegenerative diseases, including AD. Even though defective transport is considered an early pathologic event, the mechanisms by which neurodegenerative insults impact transport are poorly understood. We show that AβOs induce disruption of organelle transport in primary hippocampal neurons in culture. Live imaging of fluorescent protein-tagged organelles revealed a marked decrease in axonal trafficking of dense-core vesicles and mitochondria in the presence of 0.5 µM AβOs.NMDAR antagonists, including D-AP5, MK801 and memantine, prevented the disruption of trafficking, thereby identifying signals for AβO action at the cell membrane. Significantly, both pharmacological inhibition of glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) and transfection of neurons with a kinase-dead form of GSK-3β prevented the transport defect. Finally, we demonstrate by biochemical and immunocytochemical means that AβOs do not affect microtubule stability, indicating that disruption of transport involves a more subtle mechanism than microtubule destabilization, likely the dysregulation of intracellular signaling cascades. Results demonstrate that AβOs negatively impact axonal transport by a mechanism that is initiated by NMDARs and mediated by GSK-3β and establish a new connection between toxic Aβ oligomers and AD pathology.