Estudos para otimização do protótipo inibidor da MAPK p38 LASSBio-998 - Lopes, Raquel de Oliveira. (UFRJ, 2010)
[PT] LASSBio-998 [6-(3-cicloexilureido)-1,3-dioxola-4,5-quinolina-7-carboxilato de etila], previamente descoberto no Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas (LASSBio® - www.farmacia.ufrj.br/lassbio), consiste em novo protótipo anti-inflamatório inibidor da proteína quinase ativada por mitógeno p38 (MAPK p38), planejado por modificações moleculares do inibidor ureídico GK-00687. O presente trabalho descreve o planejamento, síntese e caracterização do perfil farmacológico (i.e. anticitocinas, anti-p38 e anti-hiperalgésico) de novos derivados ureídicos planejados por modificações moleculares na estrutura do protótipo LASSBio-998. Ademais, discorre sobre os estudos de estabilidade química, plasmática e microssomal de LASSBio-998 e de seus novos análogos. As metodologias sintéticas desenvolvidas para a obtenção dos novos análogos ureídicos basearam-se em reações de acoplamento e substituição nucleofílica, fornecendo os quatro derivados estruturalmente originais em rendimento e grau de pureza satisfatórios. Estes derivados demonstraram-se estáveis em meio ácido (pH = 1,2) e meio neutro (pH = 7,4), assim como o protótipo LASSBio-998. Estudos in vitro de estabilidade plasmática indicaram a instabilidade de LASSBio-998 em plasma de ratos (t1/2 = 76,8 minutos), embora este perfil de labilidade metabólica não tenha sido observado em plasma humano, sugerindo a participação seletiva das carboxilesterases (CES) no metabolismo plasmático deste protótipo. Por outro lado, LASSBio-1496 [2-(3-cicloexilureido)-benzoato de etila] e LASSBio-1497 [2-(3-cicloexilureido)-piridina-3-carboxilato de metila] foram metabolizados em plasma humano e murino, demonstrando não serem substratos seletivos para a ação hidrolítica das CESs.Estudos in vitro de metabolismo em microssoma hepático de ratos indicaram que as principais enzimas responsáveis pelo metabolismo de LASSBio-1495 [6-(3-cicloexilureido)-1,3-benzodioxola-5-carboxilato de metila] e LASSBio-1496 são as flavina-monooxigenases (FMOs) e/ou citocromo P450 (CYPs). LASSBio-1497 foi metabolizado tanto pelas enzimas FMOs e/ou CYPs quanto pelas CESs em microssoma hepático de ratos. Os resultados obtidos para LASSBio-998 confirmaram a seletividade deste composto para atividade das CES, descartando, em princípio, a participação do metabolismo oxidativo para este protótipo. LASSBio-1494 [2-(3-cicloexilureido)-4,5-dimetoxibenzoato de etila] apresentou-se estável tanto em plasma quanto em fração microssomal hepática de ratos. Os derivados ureídicos foram avaliados in vitro em modelo de modulação de citocinas, i.e. TNF-α e IL-1β, e inibição da fosforilação de p38, em células da linhagem THP-1 estimuladas com LPS. Os dados experimentais indicaram que a estratégia de simplificação molecular foi eficiente para o perfil de inibição de citocinas, destacando-se LASSBio-1495 e LASSBio-1497, com o perfil anticitocinas otimizado em relação ao protótipo. Além disso, os novos análogos foram capazes de inibir a fosforilação de p38, sendo que LASSBio-1494, LASSBio-1496 e LASSBio-1497 apresentaram efeito de inibição enzimática superior ao protótipo LASSBio-998. A atividade farmacológica in vivo dos derivados ureídicos foi determinada empregando-se o modelo de hipernocicepção térmica induzida por capsaicina. Neste modelo, destacou-se LASSBio-1494 como o composto mais ativo da série, por via oral, apresentando atividade anti-hipernociceptiva otimizada em relação ao protótipo LASSBio-998.Em conjunto, os resultados obtidos permitiram a descoberta de novos protótipos anti-inflamatórios estruturalmente originais, inibidores da MAPK p38, ativos por via oral, cujo perfil de estabilidade plasmática e microssomal difere de forma significativa do protótipo LASSBio-998.[EN] LASSBio-998 [ethyl 6-(3-cyclohexylureido)-1,3-dioxolo-4,5-quinoline-7-carboxylate] previously discovered by LASSBio® (Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas), is a new anti-inflammatory prototype inhibitor of mitogen-activated protein kinase p38 (MAPK p38), designed by molecular changes of p38 inhibitor, GK -00687. This work describes the design, synthesis and pharmacological profile (i.e. anticytokine, anti-p38 and antihyperalgesic) of new derivatives designed by molecular changes in the structure of the prototype LASSBio-998. Moreover, it deals with the chemical, plasma and microsomal stability studies of LASSBio-998 and its new analogues. The synthetic methodologies developed to obtain the new analogues were based on coupling reactions and nucleophilic substitution, achieving the synthesis of four derivatives structurally unique in a yield and satisfactory purity. LASSBio-998 and its news analogues were stable in hydrochloric acid (pH 1.2) and in isotonic phosphate buffer (pH = 7.4). The in vitro stability in rats and human plasma showed that LASSBio-998 is unstable in rats plasma (t1/2 = 76.8 minutes), despite the stability shown in human plasma, suggesting the selective involvement of carboxylesterases (CES) on metabolism of LASSBio-998 in rats plasma. On the other hand, LASSBio-1496 [ethyl 2-(3-cyclohexylureido)benzoate] and LASSBio-1497 [ethyl 2-(3-cyclohexylureido)-pyridine-3-carboxylate] was metabolized in rat and human plasma, demonstrating that the substrates are not selective for the hydrolytic activity of CESs. Studies in vitro with microsomes from rat liver indicated that the LASSBio-1495 [ethyl 6-(3-cyclohexylureido)-benzo-1,3-dioxole-5-carboxylate] and LASSBio-1496 are mainly metabolized by cytochrome P450 (CYPs) and/or flavin-monooxygenases (FMOs). LASSBio-1497 was metabolized in microsomes from rat liver by CYPs and/or FMOs and by CESs.The results in microsome from rat liver for LASSBio-998 confirmed the selectivity of this compound for CESs activity. LASSBio-1494 [ethyl 2-(3- cyclohexylureido)-4,5-dimethoxybenzoate] was stable in both plasma and microsomal rat-hepatic fractions. The in vivo pharmacological activity of derivatives was evaluated using the capsaicin-induced thermal hypernociception test. This test showed that LASSBio-1494 was the most active compound in the series with anti-hypernociceptive activity higher than the prototype LASSBio-998. In conclusion, the results led to the discovery of new p38 inhibitors structurally unique as anti-inflammatory prototypes, orally active, whose plasma and microsomal stabilities differ significantly from the prototype LASSBio-998.