Análise molecular de lesões causadas no DNA pela fotoquimioterapia PUVA (psoralenos + ultravioleta A) - Pereira Júnior, Marcus Vinicius de Paula (UFRJ, 2009)
[PT] A fotoquimioterapia PUVA consiste na ação combinada entre moléculas de psoralenos (furocumarinas) e a radiação ultravioleta A (UV-A – 320 a 400nm), sendo utilizada no tratamento de diferentes desordens dermatológicas, como psoríase e vitiligo, e em patologias mais graves como o linfoma cutâneo de células T. Os psoralenos são compostos tricíclicos, que possuem uma estrutura planar básica e que apresentam duas ligações duplas, sendo uma presente no anel furano (carbonos 4‟ e 5‟) e a outra no anel pirona da molécula (carbonos 3 e 4) que, quando ativadas fotoquimicamente, podem interagir com as bases pirimidínicas, resultando na formação de adutos com o DNA das células. Estas ligações formadas, do tipo anel ciclobutano, são estruturalmente estáveis, podendo ser formadas com as bases de apenas uma das fitas de DNA (monoadutos) ou, havendo uma base pirimidínica na fita oposta do DNA, forma-se uma segunda ligação (crosslink). O objetivo deste trabalho é estudar os efeitos da terapia PUVA na formação de lesões no DNA por meio de ensaios que correlacionem a eficiência dos mecanismos de reparo na remoção dos adutos PUVA e da utilização de ferramentas de análise destas lesões. Experimentos de sobrevivência bacteriana foram realizados, utilizando cepas de Escherichia coli, selvagem e mutantes em genes de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) uvrABC. Amostras de DNA bacteriano tratadas com PUVA foram extraídas e analisadas via Espectrometria de Massas e foram realizados ensaios in vitro com oligonucleotídeos tratados e analisados através de espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de 1H.Diferentes psoralenos foram utilizados nos experimentos, dentre eles: 8MOP, seu análogo monofuncional H28MOP, PSO, ANG, DMC e TMP. Os resultados indicaram que o mecanismo de reparo NER é importante na remoção dos adutos PUVA, embora alguns resultados tenham indicado uma via alternativa de reparação, com a participação da proteína UvrB. As análises de Espectrometria de Massas sugeriram a formação de uma grande variedade de lesões (dímeros, monoadutos e crosslinks) e os espectros de RMN também mostraram deslocamentos dos hidrogênios dos psoralenos que interagiram com o DNA. Tais resultados levantaram a questão do potencial genotóxico do tratamento PUVA. Os adutos formados, não sendo corretamente processados pelas células, se acumulam no DNA, com efeitos que podem levar à mutagenicidade e à geração de células neoplásicas. Desta forma busca-se a utilização de psoralenos que provoquem menos lesões e que sejam eficientes no controle das doenças de pele.[EN] PUVA photochemotherapy relays in the interplay between psoralen molecules (furocoumarines) and ultraviolet A (UV-A - 320 to 400nm). This therapy is used to treat dermatological disorders such as psoriasis and vitiligo, and lethal diseases such as cutaneous T cell lymphoma. Psoralens are tricyclic compounds that have a basic planar structure with two double bonds, each one in opposite rings, the 4‟ 5‟ bond in the furan ring and the 3, 4 bond in the pyrone ring. When activated photochemically, these regions interact with nucleic acids targets, especially with the pyrimidine bases, forming adducts with the pyrimidine bases of DNA. These cyclobutane bonds, are structurally stable and can be formed with either one of DNA strands (monoadducts) or with two opposite pyrimidine bases, forming the interstrand crosslinks. The objective of this work is the study of the PUVA effects on the formation of DNA lesions, correlating them with the efficiency of repair mechanisms for the removal of PUVA adducts. Bacterial survival experiments revealed the dependence on nucleotide excision repair (NER) to recover from PUVAinduced damage. Additionally, DNA bacterial samples were treated with PUVA and DNA extracted and analyzed by Mass Spectrometry and in vitro tests were performed with oligonucleotides, processed and analyzed by 1H Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy. Depending on the psoralen structure, mass spectrometry analysis indicates the formation of a pool of lesions (base dimers, monoadducts and crosslinks) and the NMR spectra also indicate distortions arising from the interaction between psoralens and DNA in different degrees. Altogether, these results show the genotoxic potential of PUVA treatment. If the adducts formed are not correctly processed by the cells, they accumulate in DNA, with effects that may lead to the generation of mutagenicity and neoplastic cells.This motivate the search for less-genotoxic, highly cytotoxic psoralens to control skin diseases.