Proteoma de proteobacteria : uma iniciativa da Rede Proteômica-RJ no estudo de proteínas de Vibrio cholerae e Gluconacetobacter diazotrophicus - Santos, Eidy de Oliveira (UFRJ, 2009)
[PT] A principal proposta deste trabalho foi utilizar um modelo experimental de estudo global de proteínas bacterianas. Uma espécie de importância médica, Vibrio cholerae, e outra de relevância agro-econômica, Gluconacetobacter diazotrophicus, foram analisadas, através do uso de técnicas proteômicas. A primeira descrição do proteoma de G. diazotrophicus foi alcançada, utilizando eletroforese bidimensional (2D-GE) seguida de espectrometria de massa em MALDITOF e TOF/TOF. A partir de um mapa bidimensional (2D) de proteínas de G. diazotrophicus PAL5, foram obtidas 71 identificações, que correspondem a 61 proteínas distintas. Estas proteínas possuem categorias funcionais de enzimas envolvidas no metabolismo de energia, de aminoácidos, de nucleotídeos e integrantes de processos de transferência de informação genética e de secreção protéica, chaperonas e porinas de membrana. Três proteínas hipotéticas foram detectadas, constituindo um potencial alvo para estudos genômicos funcionais. Estes dados foram inseridos em um projeto conjunto de descrição do perfil de proteínas expressas por G. diazotrophicus, desenvolvido com a participação de vários grupos da Rede Proteômica-RJ. Em paralelo, foi realizada uma análise comparativa da expressão protéica de V. cholerae sob cultivo em meio M9 com N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) ou D-glucose, como fontes únicas de carbono e energia. Neste projeto foram examinadas proteínas totais e de membrana de V. cholerae El Tor C3294, através do uso de 2D-GE seguida de espectrometria de massa em MALDI-TOF e TOF/TOF, e de eletroforese unidimensional seguida do uso do espectrômetro de massa ESI-Q-TOF. Foram construídos, 3 pares de géis 2D com faixas de pH de 4-7, 1 par com faixa de pH de 3-10 e 1 par com faixa de pH de 6-11, sendo cada integrante dos pares referentes ao cultivo com D-glucose ou GlcNAc.Através do uso do espectrômetro de massa MALDI-TOF e TOF/TOF, foram obtidas 817 identificações, referentes a 218 proteínas diferentes. A análise de proteínas de membrana resultou em 61 identificações, com 31 proteínas distintas. O estudo comparativo de todas as identificações mostrou uma mudança fisiológica de V. cholerae cultivada na presença de GlcNAc, comparado ao cultivo com D-glucose. Em resposta ao cultivo com GlcNAc, foi observado um aumento de proteínas do metabolismo de alguns aminoácidos, de chaperonas e isomerases, além de enzimas envolvidas na utilização da GlcNAc dentro da célula. Vários fatores regulatórios foram ativados em V. cholerae na presença de GlcNAc, tais como proteínas de mecanismos da osmoregulação, da manutenção do potencial redox e da resposta ao choque térmico. O cultivo em D-glucose, por sua vez, ativa a expressão de muitas proteínas hipotéticas, de uma endopeptidase ClpP, da proteína regulatória da aquisição de ferro Fur e de proteínas do transporte de maltose para dentro da célula. Os métodos utilizados nos dois projetos se mostraram eficientes, tanto na descrição do perfil protéico bacteriano, quanto na identificação de mecanismos de resposta celular a mudanças ambientais.[EN] The main purpose of this project is the use of an experimental design to study global proteins from bacteria samples. Two relevant species for medicine, Vibrio cholerae, and for agro-economy, Gluconacetobacter diazotrophicus, were analyzed, by the use of proteomic techniques. The first proteomic description of G. diazotrophicus was done, though twodimensional electrophoresis (2D-GE) utilization, followed by MALDI-TOF and TOF/TOF mass spectrometry. From a two-dimensional (2D) reference map of G. diazotrophicus PAL5 proteins, 71 identifications were obtained, derived from 61 distinct genes. These identified proteins were from functional categories of energy, amino acids and nucleotides metabolism, were members of genetic information transfer and protein secretion processes, and were chaperones and membrane proteins. Furthermore, three proteins classified as hypothetical were identified, and constitute a potential target for functional genomic studies. This data were included in a global project of broad proteomic description of G. diazotrophicus, developed with the participation of other members of Proteomic Network-RJ. In parallel, there was realized a comparative analysis of V. cholerae protein expression growth in M9 media with N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) or Dglucose as the sole carbon and energy source. In this project there were researched the whole proteins and separated membrane proteins, by the use of 2D-GE followed by MALDI-TOF and TOF/TOF mass spectrometry, and one-dimensional electrophoresis coupled to ESI-Q-TOF mass spectrometer. Three pairs of 2D gels with pH 4-7 range, one pair with pH 3-10 range and one pair with pH 6-11 range were constructed, and each member of the pairs corresponds to glucose or GlcNAc growth. By the use of MALDI-TOF and TOF/TOF spectrometers, there were identified 817 spots, which include 269 distinct proteins.Membrane analysis resulted in 61 identifications, for 31 different proteins. The comparative assays with all these identifications shown a physiologic variation of V. cholerae grown in the presence of GlcNAc, compared to the glucose growth. The response of V. cholerae to GlcNAc take in a higher amino acid metabolism and secretion of membrane proteins, chaperones and isomerases expression increase. As expected, the expression of enzymes of the utilization pathway of GlcNAc was higher. Several regulatory factors were activated by the presence of GlcNAc, as the osmoregulation control regulators, the redox regulators and the heat shock regulon. The growth of V. cholerae in presence of D-glucose increased the expression of many hypothetical proteins, a ClpP endopeptidase, the Fur regulatory protein of iron acquisition and maltose transport proteins. The methods utilized in this work were successful for proteomic description and for environmental changes response study.