Secreção de metaloproteinase-9 (MMP-9) de matriz em macrófagos murinos induzida por heme : envolvimento do estresse oxidativo e possíveis implicações no processo inflamatório - Gonçalves, Kathleen Silva da (UFRJ, 2009)
[PT] As metaloproteinases de matriz (MMPs) são proteases dependentes de cálcio e zinco com capacidade para degradar componentes da matriz extracelular (ECM). Além da degradação da matriz, que facilita o remodelamento tecidual e a migração celular, sua atividade pode resultar na geração de epítopos que atuam como ativadores celulares, assim como na liberação de fatores de crescimento e citocinas aprisionados na ECM. A literatura mostra que MMPs podem ter sua atividade regulada por espécies reativas de oxigênio (ROS). Os radicais livres e o estresse oxidativo provocado por eles, poderiam afetar a atividade das MMPs tanto diretamente, por meio da oxidação de domínios específicos, como indiretamente, ao modular sua expressão via elementos sensíveis a redução/oxidação tais como NFkB e AP-1, que possuem sítio de ligação na região promotora do gene das MMPs. Nosso grupo e outros têm mostrado que o heme é uma potente molécula próinflamatória, capaz de induzir a ativação de macrófagos e neutrófilos humanos. Como o heme está envolvido na geração de estresse oxidativo, por induzir a geração de ROS, decidimos investigar se esta molécula estaria envolvida na secreção da MMP-9. Para isto, realizamos experimentos in vitro, utilizando como modelo cultura de macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7 . Para análise do fenômeno in vivo optamos por um modelo de inflamação pulmonar em camundongos da linhagem C57BL/6. Primeiramente, incubamos as células RAW com diferentes concentrações de hemoglobina e heme e medimos a atividade da pró-MMP-9 por zimografia. Em seguida, confirmamos a habilidade do heme em induzir a produção de superóxido neste tipo celular utilizando a técnica de redução do citocromo c SOD-inibida. Nossos resultados indicam uma clara indução do superóxido, de forma dosedependente, pelo heme.A indução da secreção da pró-MMP9 pelo heme foi inibida pelo pré-tratamento com o antioxidante N-acetil-cisteína e pelo inibidor da atividade da NADPH oxidase DPI, sugerindo um provável papel de ROS neste evento. Posteriormente, injetamos diferentes concentrações de heme na traquéia de camundongos com o objetivo de simular um processo inflamatório pulmonar. Após 24 e 48 horas do estímulo, realizamos lavados broncoalveolares (BAL) que foram utilizados para contagem diferencial de células e análise da atividade de MMP-9 por zimografia. Também foram feitos extratos de pulmões para análise da expressão de MMP-9 por Western Blot. Os resultados encontrados mostraram um aumento de células inflamatórias nos tempos analisados. O BAL indicou um aumento significativo na secreção da MMP em 48 horas, assim como o Western Blot aponta para um aumento na quantidade desta MMP-9 em todo o órgão. Mostramos ainda, in vitro, que macrófagos alveolares aumentam a secreção de MMP-9 ao serem estimulados com o heme. Juntos, nossos resultados sugerem que a liberação de heme após eventos hemolíticos ou hemorrágicos podem aumentar a secreção da MMP-9 em macrófagos, o que por sua vez, desempenharia um papel importante na promoção da remodelagem tecidual/vascular associada a processos inflamatórios.[EN] Matrix metalloproteinases (MMPs) are calcium- and zinc-dependent proteases that have the combined capacity to degrade several components of the extracellular matrix. Besides the degradation of extracellular matrix (ECM), which facilitates tissue remodeling and cell migration, their activity can result in the generation of epitopes that act as cell effectors as well as in the release of ECM sequestered growth factors and cytokines. Several works demonstrated that MMPs can be their expression regulated by reactive oxygen species (ROS). Free radicals, and the resulting oxidative stress, could affect the activity of MMPs both directly, through the oxidation of critical domains, and indirectly by modulating its expression through redox-sensitive elements such as NFκB and AP-1 that are known to be an integral part of the binding sites for MMP transcription. We and others have shown that heme is a potent pro-inflammatory molecule, able to induce the activation of human neutrophils and macrophages. Since heme is involved in the generation of oxidative stress by promoting ROS production we sought to investigate whether this molecule would be involved in the secretion of MMP-9. We thus performed in vitro experiments with culture murine macrophage RAW 264.7 cells. To verify the same in vivo phenomenon, we chose a mouse pulmonary inflammation model. We first incubated the RAW cells with different concentrations of both, hemoglobin and heme. After that we measured the activity of pro-MMP-9 by zimography. Next we confirmed the ability of heme to induce superoxide production in this cells by using SOD-inhibitable cytochrome c reduction. Our results indicated a clear dose-dependent induction of superoxide by heme.The induction of pro-MMp-9 secrection by heme was blocked by pre-treatening the cells with N-acetyl-cystein (antioxidant) and DPI (NADPH oxidase inhibitor) suggesting the potential involvement of ROS in this event. Later we injected different concentrations of heme intratracheally in mouse aimed to simulate a pulmonary inflammatory process. After 24 and 48 hours from stimulus we collected a bronchoalveolar lavage (BAL) to verified the airway cellular accumulation and zimography analysis. Pulmonary extracts were prepared to Western Blot analysis of MMP-9 expression. The found results demonstrated an increased in number of inflammatory cells in both times. The challenge with heme caused a significant increased in BAL MMP-9 secretion in 48 hours, as well as the Western Blot analysis indicated to increase in MMP-9 expression in all lung. We found that MMP-9 secretion in alveolar macrophage is incresead by heme too. Taken together, our results suggest that release of heme after hemolytic or hemorrhagic events can increase the macrophage secretion of MMP-9, which could in turn, play an important role by promoting tissue/vascular remodeling associated to inflammatory process.