Identificação de genes relacionados ao desenvolvimento reprodutivo apomítico e sexual em Brachiaria brizantha - Silveira, Érica Duarte (UFRJ, 2009)
[PT] A apomixia é um modo de reprodução assexual por sementes, gerando uma progênie idêntica a planta mãe. Ela se difere da reprodução sexual em duas etapas: alteração da meiose e ativação da oosfera para o desenvolvimento do embrião independente da fertilização. A apomixia raramente é obrigatória e geralmente coexiste com sexualidade na mesma planta. O objetivo desse trabalho foi analisar o perfil de expressão de genes durante o desenvolvimento do megagametófito de B. brizantha apomítica e sexual para caracterizar genes associados à apomixia. Etiquetas de sequenciamento (ESTs) de bibliotecas de ovários em megasporogênese e megagametogênese foram analisadas. Foram identificadas similaridades de alguns ESTs a genes do desenvolvimento reprodutivo em outras plantas. Foram selecionados oito ESTs considerando a similaridade a genes referência para RT-qPCR. BbrizUBCE (enzima de conjugação à ubiquitina) e BbrizEF1 (fator de elongação 1 alpha), foram considerados bons normalizadores para estudos de expressão relativa de órgãos vegetativos e reprodutivos e, além destes, BbrizE1F4 (fator 4 de iniciação eucariótica), como normalizadores para RT-qPCR de ovários exclusivamente. Sequências de expressão diferencial em ovário de B. brizantha apomítica e sexual foram identificadas por macroarranjo e RT-qPCR: BbrizSti1 (proteína induzida por estresse), BbrizHelicase, BbrizERD (proteína de resposta à desidratação), BbrizRanGTP, e BbrizSec13 (proteína putativa tipo Sec 13). Transcritos de BbrizSti1 e BbrizHelicase foram detectados durante os estágios de desenvolvimento do megagametófito, sugerindo papel durante sua formação. Em outras espécies genes relacionados à resposta a estresse foram associados à embriogênese somática e também à apomixia.Visando restringir as análises às células inicias apospóricas, foi estabelecido protocolo de microdissecção à laser (LCM.) para ovários de Brachiaria e isolado RNA mensageiro de células desta região e de células nucelares. O RNA mensageiro obtido por LCM, juntamente com RNA isolado de ovários em megasporogênese e megagametogênese de B. brizantha apomítica e sexual, estão em sequenciamento de larga escala, que permitirá detectar e comparar o conjunto de genes expressos nessas células. Esse trabalho contribui ao aumento do conhecimento da biologia molecular do desenvolvimento reprodutivo de Brachiaria e da apomixia de modo geral.[EN] Apomixis is an asexual mode of plant reproduction through seeds, giving rise to identical progeny from maternal origin. It differs from sexual reproduction in two major steps: circumvention of meiosis and egg cell activation for embryo development independently of fertilization. Apomixis is rarely obligate and usually both sexual and apomictic reproductions coexist in the same plant. The objective of this work was to analyze the expression profile of genes during the development of apomictic and sexual megagametohpyte of B. brizantha to identify and characterize genes related to apomixis. Expressed sequence tags (ESTs) from cDNA libraries of ovaries in megasporogenesis and megagametogenesis were analyzed. Sequences with similarity to genes already associated to reproductive development in other plant species were identified in these libraries. Eight genes were also selected from these libraries, considering their similarity to reference genes. BbrizUBCE, similar to ubiquitin conjugating enzyme; BbrizEF1, similar to elongation factor 1 alpha were the best reference genes for relative expression studies in vegetative and reproductive tissues. For ovaries of both sexual and apomictic B. brizantha these two plus BbrizE1F4A, similar to eucaryotic initiation factor 4 were the best normalizers. Differentially expressed sequences were identified and characterized through macroarray, RT-qPCR and in situ hybridization: BbrizSti1, similar to stress induced protein 1, BbrizHelicase, BbrizERD, similar to early response to dehydration, BbrizRan GTP and BbrizSec13 showed much higher expression in apomictic ovaries in RT-qPCR expression, but for BbrizSti1 and BbrizHelicase its expression was localized in both ovaries of sexual and apomictic plants. In other species, stress response genes have been associated to somatic embriogenesis and also apomixis.In order to restrict the analysis to aposporous inicial cells, laser microdissection (LMD) protocol was stablished to Brachiaria ovaries and RNA was isolated from these cells and also from nuclear cells. Messenger RNA from microdissection, together with RNA from whole ovaries of sexual and apomictic B. brizantha are being sequenced. This will allow us to detect and compare gene expression profile of these cells. This work contributed to the knowledge of the molecular biology of reproductive development of Brachiaria and also for apomixis.