Estudos funcionais de duas histona acetiltransferases de Schistosoma mansoni : SmGCN5 e SmCBP1 - Santos, Renata de Moraes Maciel dos (UFRJ, 2008)
[PT] Atividades relacionadas ao DNA como transcrição, replicação e reparo, estão associadas com alterações na estrutura da cromatina e nucleossomos. Essas mudanças estruturais são em parte mediadas pela acetilação reversível da região amino terminal das histonas. Os co-ativadores transcricionais CBP/p300 e PCAF/GCN5 estão presentes em um complexo multifuncional e funcionam em conjunto com vários fatores transcricionais. HMGB1 é uma proteína nãohistona de ligação ao DNA que funciona como um co-fator estrutural crítico para a regulação transcricional apropriada em células somáticas. Ela promove um dobramento no DNA e facilita a ligação de diversos complexos protéicos de regulação ao DNA. Está bem estabelecido que os co-ativadores são levados ao promotor de genes alvo através da interação com fatores de ligação ao DNA específicos, e atuam como acetiltransferases que acetilam histonas e fatores de transcrição. Foram clonadas duas acetiltransferases de S. mansoni: SmCBP1 e SmGCN5. Os domínios catalíticos de ambas SmCBP1 e SmGCN5 foram suficientes para promover a acetilação específica das histonas H3 e H2A. O resíduo de lisina 14 da histona H3 foi identificado como o sítio específico de acetilação tanto para SmCBP1 como para SmGCN5. É descrito que a acetilação da lisina 14 na histona H3 está diretamente relacionada com a ativação transcricional, portanto, sugerimos que ambas as acetiltransferases do esquistossomo desempenham um papel na ativação gênica. Essa sugestão é reforçada pelos os dados obtidos por microscopia eletrônica, onde se identificou a proteína SmGCN5 no núcleo das células do esquistossomo, especificamente em regiões de eucromatina, estrutura da cromatina com atividade transcricional. SmGCN5 também é capaz de acetilar proteínas nãohistona, como os receptors nucleares SmRXR1 e SmNR1, e o co-ativador SmNCoA-62.Através de ensaios in vitro de “pull down”, foram mapeados os domínios de interação dos coativadores de RNs de S. mansoni, SmGCN5 e SmCBP1, com SmRXR1 e SmNR1. As histona acetiltransferases de S. mansoni também foram testadas para a sua habilidade de acetilação in vitro da SmHMGB1 e sua forma truncada sem a cauda ácida C-terminal (SmHMGB1 ΔCA). Tanto a proteína inteira SmHMGB1, como o seu domino box B (mas não o domíno box A) foram substratos para SmGCN5 e SmCBP1. A remoção da cauda ácida C-terminal resultou em um aumento de acetilaçãoda SmHMGB1. As proteínas SmHMGB1 ou SmHMGB1 ΔCA não apresentaram diferença na atividade de superenovelamento de DNA após serem acetiladas por SmGCN5 ou SmCBP1. No entanto, a proteína SmHMGB1 foi transportada do núcleo para o citoplasma, após o tratamento com butirato de sódio. Esses dados reunidos sugerem que a acetilação da SmHMGB1 desempenha um papel no transporte subcelular da proteína, mas não tem influência na sua atividade de superenovelamento do DNA.[EN] DNA-related activities such as transcription, replication, and repair are associated with modifications in the structure of chromatin and nucleosomes. These structural changes are in part mediated by the reversible acetylation of the amino termini of the core histones. The transcriptional co-activators CBP/p300 and PCAF/GCN5 are present in a multiprotein complex and function in concert with a variety of transcriptional factors. HMGB1 is a nonhistone DNA-binding protein that functions as a structural cofactor critical for proper transcriptional regulation in somatic cells. It promotes DNA bending and facilitates the binding of several regulatory protein complexes to DNA. It is now well established that coactivators are brought to the promoter of target genes through the interaction with specific DNA-binding factors, and act as acetyltransferases that acetylate histones and transcriptional factors. Two acetyltransferases from schistosome have been cloned: SmCBP1 and SmGCN5. The HAT catalytic domain of both SmCBP1 and SmGCN5 were sufficient to promote specific acetylation of histones H3 and H2A. The lysine 14 residue of histone H3 has been identified as the specific site of acetylation for SmCBP1 and SmGCN5. Since it is known that acetylation of lysine 14 in Histone H3 is directly related to transcription activation, we suggest that both schistosome acetyltransferases play a role in gene activation. This suggestion is reinforced with the data obtained by electron microscopy, where SmGCN5 was identified in the nuclei of schistosome cells, specifically in euchromatin regions, which is the active transcriptional form of the chromatin. SmGCN5 was also able to acetylate schistosome non-histone proteins, such as the nuclear receptors SmRXR1 and SmNR1, and the co-activator SmNCoA-62.By using in vitro pull-down assays, the interaction domains of S. mansoni NR co-activators, SmGCN5 and SmCBP1, with the nuclear receptors SmRXR1 and SmNR1 were mapped. Both S. mansoni histone acetyltransferases were also tested for their ability to in vitro acetylate SmHMGB1 and its truncated form lacking the C-terminal acidic tail (SmHMGB1 ΔCA). We found that full-length SmHMGB1, as well as its HMG-box B (but not HMG-box A) were substrates for SmGCN5 and SmCBP1. Removal of the C-terminal acidic tail resulted in increased acetylation of SmHMGB1. SmHMGB1 or SmHMGB1 ΔCA revealed no difference in their DNA supercoiling activities after being acetylated by SmGCN5 or SmCBP1. However, SmHMGB1 protein was transported from the nucleus to the cytoplasm, after sodium butyrate treatment. Together, our data suggest that acetylation of SmHMGB1 plays a role in the subcelular trafficking of the protein, but not in its DNA supercoiling activity.