Análise do efeito lócus agr sobre a formação de biofilme em cepas de Staphylococcus aureus - Cruz, Raquel Souza (UFRJ, 2008)
[PT] O Staphylococcus aureus é um importante patógeno de humanos, capaz de causar tanto infecções adquiridas na comunidade como nos hospitais. A expressão de muitos fatores de virulência estafilocócicos é regulada por sistemas globais de regulação gênica, incluindo o Agr (principal sensor de densidade populacional dos estafilococos). Amostras de S. aureus são reconhecidas como importante causa de infecções relacionas ao uso de cateteres e próteses, as quais estão associadas à formação de um filme bacteriano (biofilme) sobre superfícies de dispositivos médicos. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel do sistema Agr no desenvolvimento do biofilme de S. aureus, utilizando construções agr-nulas derivadas de amostras clínicas. As amostras utilizadas neste estudo foram derivadas de S. aureus sensíveis ou resistentes à meticilina pertencentes a linhagens internacionais circulantes em hospitais ou em comunidades de diversos países (representantes do clone pediátrico, clone Nova Iorque/Japão, EMRSA 16, clone epidêmico brasileiro e do CA-MRSA). As construções agr-nulas foram geradas através da troca alélica do agr pelo gene tetM (codifica para resistência à tetraciclina), através de recombinação homóloga via bacteriófago 80, após propagação na RN6911 (Δagr::tetM). A complementação da função do Agr foi obtida através da aquisição de um plasmídeo contendo a fusão Pbla-rnaIII-cat. Mutantes agr foram selecionados na presença de antibiótico e confirmados através de PCR, hibridização pela técnica de dot-blotting, Northern-blotting, RT-PCR, utilizando primers e sonda específicos para um fragmento interno do rnaIII. O background genético das amostras selvagens e mutantes isogênicos foi confirmado através da técnica de eletroforese em campos elétricos pulsados.Um total de 14 mutantes agr-nulos, representativos das diferentes linhagens internacionais, foram obtidos. A complementação do rnaIII foi obtida para 5 desses mutantes, nos quais o agr havia sido eliminado. O biofilme foi formado na superfície inerte de poliestireno das microplacas de titulação e as leituras espectrofotométricas determinadas após coloração do biofilme com cristal violeta. Esta metodologia foi validada através da visualização do filme bacteriano formado através de microscópio de varredura confocal à laser. Nossos dados demonstraram que o agr pode modular de forma divergente o biofilme de S. aureus. A eliminação do agr pôde tanto aumentar a formação de biofilme (nas amostras apresentando fenótipo não-produtor/fraco) como diminuir (nas amostras apresentando fenótipo moderado/forte produtor); ou ainda pôde exercer um efeito neutro sobre o filme biológico. O fato de que diferentes produtos regulados positivamente (incluindo, δ- e α-hemolisinas) e negativamente (tais como, FnBpAB) pelo agr terem sido implicados na formação do biofilme pelos S. aureus poderia, possivelmente, explicar os resultados aqui obtidos. Finalmente, desde que o agr pôde regular negativamente o biofilme em algumas amostras de S. aureus, dúvidas são levantadas quanto ao potencial das estratégias terapêuticas fundamentadas no uso de inibidores agr para se bloquear o desenvolvimento de biofilme por essas bactérias.[EN] Staphylococcys aureus is a major human pathogen that is able to cause either community or hospital acquired-infections. The expression of many staphylococcal virulence factors are finely regulated by global systems of gene regulation, including agr locus (the main staphylococcal quorum sensing). S. aureus isolates are recognized as important cause of catheter- and prosthesisrelated infections, which are associated with the bacterial ability to form biofilm on the surfaces of medical devices. The aim of this study was to evaluate the role of Agr system on biofilm formation using agr-null constructions derived from current clinical isolates of S. aureus. The isolates used in this work are methicillin-susceptible (MSSA) or –resistant (MRSA) S. aureus related to international lineages that are circulating in hospitals or in communities in different countries (including representatives of pediatric clone, New York/Japan clone, EMRSA 16, Brazilian epidemic clone and USA400 CA-MRSA). The agrnull constructions were generated by replacement of the whole agr by the tetM gene (codifying for tetracycline resistance), using homologous recombination via 80α bacteriophage after propagation in RN6911 (Δagr::tetM). The complementation of the agr function in some agr-null constructions was achieved by the acquisition of a plasmid carrying Pbla-rnaIII-cat fusion. agr mutants were selected in the appropriated antibiotic and the agr-elimination and rnaIII complementation were confirmed by PCR, dot-blot hybridization, Northern-blotting and RT-PCR, using specific primers or probe for an internal fragment of the rnaIII. The genetic background of the isolates and isogenic mutants was confirmed by pulsed-field electrophoresis. A total of 14 agr-null constructions representatives of different international lineages were obtained. rnaIII-complementation was carried out for 5 of these agr-deleted mutants.The biofilm was formed on the inert polyestirene surface of microtitre plates and the spectrophotometric determinations were carried out after violet crystal staining. This methodology was validated by the visualization of the bacterial film formed by confocal scanning laser microscopy. Our data showed agr can divergently modulates biofilm formation in S. aureus. The agr elimination could either increase (in the isolates displaying non-producer/weak producer phenotype) or decrease biofilm formation (in moderate/strong producers); or even display a neutral effect on the biological film. The fact that different agr up-regulated (including δ- and α-hemolysins) and down-regulated (such as FnBpAB) products have been implicated on S. aureus biofilm formation would possibly explain the results obtained here. Finally, because agr could up-regulate biofilm in some S. aureus isolates one might be skeptical about the potential of therapeutic strategies fundamented in the use of agr inhibitors to block biofilm development by these bacteria.