Caracterização dos efeitos de espécies reativas de oxigênio (EROs) na ativudade ATPásica da H+-ATP sintase de cloroplastos - Ribeiro, Adriana Schlecht (UFRJ, 2006)
[PT] Espécies reativas de oxigênio (EROs) geradas intra e extracelularmente podem induzir diversas modificações de macromoléculas biologicamente fundamentais. Devido a sua alta concentração de oxigênio e ao alto fluxo de elétrons, os cloroplastos podem ser expostos a riscos de estresse oxidativo aumentado. Aqui, nós examinamos o efeito do estresse oxidativo sobre a H+-ATPase de cloroplastos (CF0F1). Os efeitos do estresse oxidativo sobre a atividade ATPásica da enzima foram estudados após a incubação da enzima com 50 µM Fe2+ + 6 mM ascorbato + 1.5 mM H2O2 (reagentes de Fenton) por 60 minutos a temperatura ambiente. Este tratamento resultou na inativação da ATPase em 50 %. A adição de Mg2+ ou nucleotídeos não preveniu este efeito. A análise eletroforética da enzima oxidada em gel de poliacrilamida SDS-PAGE revelou que a proteína não sofre fragmentação. A inibição da atividade ATPásica não foi prevenida pelo butilhidroxitolueno (BHT), sugerindo que a inibição não é devido a peroxidação lipídica. A combinação de seqüestradores de radicais livres, tais como o manitol ou dimetil sulfóxido (DMSO), e enzimas antioxidantes, como a catalase ou superóxido dismutase, revelou que os radicais livres hidroxil e superóxido não são os principais responsáveis pelo dano na CF0F1. A diminuição na atividade ATPásica foi prevenida e parcialmente revertida pelo ditiotreitol (DTT) e o estresse oxidativo não teve efeito na enzima previamente oxidada pelo ácido o-iodosobenzoato (IBZ), um reagente que oxida somente grupos sulfidrilas. A incubação da enzima com N-etilmaleimida (NEM) mimetizou o efeito do estresse oxidativo, indicando que a modificação de grupos sulfidrilas possa estar envolvida na inativação da CF0F1.F a 350 nm e a adição de DTT apresentou efeito protetor, indicando que o sistema oxidativo induz à agregação. Medidas de turbidez mostraram mudanças na absorbância da CF01 A ligação da CF1 à porção CF0 influencia nas características da enzima de diversas formas. Logo, os efeitos do Sistema de Fenton sobre as atividades da CF0F1 e CF1 foram comparados. O efeito inibitório do sistema oxidativo na atividade ATPásica da CF1 é menor que o efeito na CF0F1. O tratamento da CF1 com IBZ não inibiu a atividade ATPásica da enzima, um indicativo de que a CF1 encontra-se em sua forma oxidada. O número de grupos sulfidrilas acessíveis da enzima antes e depois do tratamento foi similar. A redução da enzima com DTT aumenta o efeito inibitório do sistema de Fenton. O tratamento oxidativo resultou em uma leve fragmentação da subunidade γ. O efeito inibitório está associado à oxidação de pontes dissulfeto na subunidade γ. A produção do radical ascorbil no sistema oxidativo foi observada por EPR tanto na presença quanto na ausência de H2O2. Nossos resultados sugerem que o radical ascorbil, o qual é observado acumular durante o estresse de plantas, foi o principal responsável pela inativação da enzima.[EN] Reactive oxygen species (ROS) generated from various intracellular and extracellular sources can induce several modifications of biologically fundamental macromolecules. Due to their very high oxigen concentration and electron flux, the chloroplasts might be exposed to risks of increased oxidative stress. Here, we examined the effect of oxidative stress on purified soluble F0F1-ATPase from chloroplasts (CF0F1). The effects of oxidative stress on CF0F1-ATPase activity were studied by incubating the enzyme with 50 µM Fe2+ + 6 mM ascorbate + 1.5 mM H2O2 (Fenton reagents) for 60 min at room temperature. This treatment resulted in inactivation of the ATPase (50% of control activity). Addition of Mg2+ or nucleotides did not prevent inactivation. Electrophoretic analysis of the oxidized CF0F1 on SDS-PAGE revealed no fragmentation of the enzyme. The inhibition of the ATPase activity was not prevented by butylhydroxytoluene (BHT), suggesting that inhibition was not directly due to lipid peroxidation. Combination with radical scavengers such as mannitol or dimethyl sulfoxide (DMSO) and antioxidant enzymes, as catalase or superoxide dismutase, revealed that hydroxyl and superoxide anion radicals were not the main responsible for the damage on CF0F1. The decrease in ATPase activity was prevented and partially reverted by dithiothreitol (DTT) and the oxidative stress had no effect on CF0F1 previously oxidized by oiodosobenzoic acid (IBZ), a reagent that oxidizes only vicinal dithiols. Incubation of the enzyme with N-ethylmaleimide (NEM) mimicked the effect of oxidative stress, indicating that sulfhydryl group modification is involved in CF0F1 inactivation. Turbidity measurements showed changes in absorbance of CF0F1 at 350 nm and the addition of DTT had a good protective effect, indicating that oxidative system induced aggregation.Binding of CF1 to CF0 influences the characteristics of the enzyme in several ways. Therefore, the effects of Fenton system on the ATPase activities of CF0F1 and CF1 were compared. The inhibitory effect of Fenton system on CF1 is lesser that on CF0F1, as inhibited slightly the ATPase activity of CF1. The treatment of CF1 with IBZ did not inhibited the ATPase activity of the enzyme, indicating that the CF1 is in the oxidized form. The number of acessible –SH groups of CF1 before and after the treatment was similar. Reduction of the enzyme with dithiothreitol (DTT) enhances the effect inhibitory of Fenton system. The oxidative treatment has resulted in the mild fragmentation of the γ subunit. The inhibition was associated with the oxidation to disulfide bonds in γ subunit. Production of ascorbyl radical in the system was identified by EPR both in the presence or absence of H2O2, and was higher in its presence. Our results suggest that the ascorbyl radical, which is known to accumulate during plant stress, was the main responsible for enzyme inactivation.