Ecto-enzimas relacionadas ao metabolismo de nucleotídeos e fosfato em túbulos de malpighi de Rhodnius prolixus - Ferraro, Rodrigo Barbosa (UFRJ, 2004)
[PT] O Rhodnius prolixus é um inseto hematófago, um dos responsáveis pela transmissão da doença de Chagas. A sua alimentação se caracteriza pela ingestão de largas quantidades de sangue em uma simples alimentação. Os túbulos de Malpighi presentes no R. prolixus têm a função primária de transporte transepitelial, resultando na excreção do excesso de íons e água, com a função dos rins nos mamíferos. Nesse estudo nós detectamos e caracterizamos as atividades ecto-ATPásicas, ecto-fosfatásicas e identificamos a presença de uma atividade ecto-cinásica em túbulos de Malpighi de R. prolixus. A atividade ecto-ATPásica se mostrou estimulada de maneira dose dependente por MgCl2 e MnCl2, com um valor máximo de saturação na casa de 1mM. Os túbulos apresentam uma atividade independente de Mg+2 (10,09 nmol Pi x mg-1 x min-1) e uma atividade dependente de Mg+2 (12,19 nmol Pi x mg-1 x min-1). A atividade independente de Mg+2 se mostrou insensível ao pH enquanto que a atividade dependente de Mg+2 foi estimulada pelo aumento do pH. A atividade foi insensível aos inibidores de ATPases do tipo P, V e F, de fosfatase e de nucleotidase. As atividades ecto-ATPásicas foram inibidas por DIDS, uma molécula não permeável à célula, e a suramina, um antagonista de receptores purinérgicos do tipo P2 e inibidor de ecto-ATPases. Os túbulos foram capazes de hidrolisar outros nucleosídeos tri-fosfatados como UTP, ITP, CTP e GTP. Ambas as enzimas apresentam Km aparente para o ATP e Vmáx semelhantes indicando terem a mesma capacidade de hidrolisar o ATP extracelular. Os túbulos apresentaram, também, uma atividade ecto-ADPásica e ecto-5’-nucleotidásica, ambas estimuladas por Mg+2. A atividadeecto-ATPásica dependente de magnésio foi inibida pela alimentação sangüínea em 51% no quarto dia, retornando aos valores basais no décimo terceiro dia. Com estabelecimento e validação de uma metodologia HPLC de fase reversa íon-pareadaisocrática foi possível observar a degradação seqüência do ATP até adenosina pelos túbulos de Malpighi. A ecto-fosfatase hidrolisou o substrato p-NPP com atividade de 3.38 +- 0.07 nmol Pi x mg-1 x min-1. A atividade diminuiu com o aumento do pH. Inibidores clássicos de fosfatase ácida como molibdato de amônio, fluoreto, vanadato, mpV-PIC e bpV-PHEN, tiveram diferentes padrões de inibição. A ecto-fosfatase apresentou Km aparente de 1.67 +- 0.34 mM e Vmáx of 5.71 +- 0.37 nmol Pi x mg-1 x min-1 para o p-NPP. O cloreto de zinco inibiu 78,2% a atividade, com Ki de 0,35 mM. A inibição foi convertida pela incubação com cisteina e GSH, mas não por DTT, serina e GSSG, mostrando que resíduos de cisteina são importantes para atividade enzimática. A atividade foafatásica aumentou 141% três dias após a alimentação com sangue, retornando aos valores basais 2 dias após. Esses resultados sugerem o envolvimento da atividade ecto-fosfatásica no mecanismo diurético, essencial nos primeiros dias após a alimentação de sangue para o controle da homeostase do Rhodnius. Os túbulos apresentam em sua superfície uma atividade ecto-cinásica que é estimulada por MgCl2. Os níveis de fosforilação das proteínas da superfície do túbulo foram aumentados quando a atividade ecto-cinásica foi ensaiada na presença de inibidores da ecto-fosfatase, indicando que essas duas atividades trabalham juntas na modulação dos níveis de fosforilação nos túbulos de Malpighi.[EN] Rhodnius prolixus is a hematophagous insect, one of the transmitters of Chagas’Disease. This insect ingests large volume of blood during feeding session. The primary function of the Malpighian tubules is the transepithelial transport, causing the secretion of ions and water excess. In insects, they are considered to be the organ with the same function played for the kidneys in the vertebrates. In this work, we detect and characterized the ecto-ATPase, ecto-phosphatase activities and identified an ecto-kinase activity in Malpighian tubules of R. prolixus. The ecto-ATPase activity was stimulated in a dose dependent manner by MgCl2 and MnCl2, with maximum saturation value of 1 mM. The tubule has shown an Mg-independent activity (10,09 nmol Pi x mg-1 x min-1 ) and an Mgdependent activity (12,19 nmol Pi x mg-1 x min-1 ). Mg-independent activity was not stimulated by pH, but the Mg-dependent activity was stimulated by increasing of pH. The activity was show insensibility to the inhibitors of P, V F-type ATPases, phosphatases and nucleotidases. The ecto-ATPases activities had been inhibited significantly by DIDS, a cellular impermeable molecule, and by suramine, an inhibitor of ecto-ATPases and an antagonist of P2-type purinergic receptor. The tubules hydrolyze others tri-phosphate nucleosides such as: UTP, ITP, CTP and GTP. Both the enzymes are observed to present similar apparent Km and Vmax indicating that have the same capacity to hydrolyze extracellular ATP. The tubules had presented to possess, also, an ecto-ADPase and ecto-5’- nucleotidase activities, both stimulated by Mg+2. The Mg dependent ecto-ATPase activity was inhibited in 51% by blood meal in the fourth day, and returned to basal levels in the 14 day.With the set up and validation of an isocratic ion-pair reversed-phase high-performance HLPC methodology, we determinate de sequential hydrolysis of ATP to adenosine by Malpighian tubules. The ecto-phosphatase hydrolyses the substrate p-nitrophenyl phosphate at a rate of 3.38 ± 0.07 nmol Pi x mg-1 x min-1 . Phosphatase activity decreased with the increase of the pH. Classical inhibitors of acid phosphatase, such as ammonium molybdate, fluoride, vanadate, mpV-PIC and bpV-PHEN, caused different patterns of inhibition. The ecto-phosphatase present an apparent Km of 1.67 ± 0.34 mM and Vmax of 5.71 ± 0.37 nmol Pi x mg-1 x min-1 for p-NPP. Zinc chloride inhibited 78.2 % of ecto-phosphatase activity, with Ki of 0.35 mM. Such inhibition was reversed by incubation with cysteine and GSH, but not DTT, serine and GSSG, showing that cysteine residues are important for enzymatic activity. Phosphatase activity increased 141 % three days after blood meal, and returned to basal levels 2 days later. These results suggest that ecto-phosphatase activity could be involved in a diuretic mechanism, essential in the initial days after a blood meal for the control of Rhodnius homeostasis. The tubules show in its surface and MgCl2 ecto-kinase activity. The surface protein phosphorylation levels has increased when the ecto-kinase activity was tested in the presence of ecto-phosphatase inhibitors, this result shown that this two activities work together in the phosphorylation level modulation in Malpighian tubules.