Estudo do mecanismo de ação da endostatina, um paotente inibidor de angiogênese - Reis, Renata Cristine Manfrinato (UFRJ, 2005)
[PT] Endostatina, o fragmento C-terminal de 20 kDa do colágeno XVIII, um proteoglicano de membrana basal, é um potente inibidor de angiogênese e crescimento tumoral. Dado seu considerável potencial como um agente terapêutico anti-câncer, objetiva-se conhecer melhor seu mecanismo de ação visando aumentar a eficácia de futuros testes clínicos. Esse trabalho buscou investigar se a endostatina inibe os efeitos promovidos por FGF-2 e VEGF, através da competição com moléculas de heparan sulfato. A fim de estudar esta proposta, empregamos dois diferentes modelos celulares, células endoteliais de microvasos humanos (HMVEC) e células progenitoras neurais. Inicialmente foi estabelecido um ensaio de proliferação usando HMVEC, estimuladas por VEGF165 e FGF-2. A endostatina inibiu 79 e 95% da proliferação estimulada por VEGF165 e FGF2, respectivamente. Para confirmar se este efeito inibitório envolvia competição por GAGs, a heparina foi utilizada nos ensaios. O efeito estimulatório de VEGF165 não foi afetado pela presença de heparina exógena, enquanto que FGF-2, teve seu efeito aumentado na presença de heparina em concentrações até 0,1 µg/ml. A adição de protamina, uma proteína altamente básica, bloqueou a proliferação estimulada por FGF-2, enquanto que esta proteína não afetou a resposta para VEGF165. A adição simultânea de endostatina e protamina levou a efeitos aditivos tanto na inibição da proliferação quanto na indução de apoptose. Embora tenha sido observado que FGF-2 apresenta uma maior afinidade por heparina do que endostatina em ensaios de ligação a coluna de heparina-sepharose, a endostatina afetou a formação do complexo heparina-protamina em solução enquanto FGF-2 não afetou. A endostatina reverteu a diferenciação de células progenitoras neurais induzida por FGF-2 e a maturação de neurônios induzida por VEGF165.Portanto, a endostatina se contrapõe a ambos, VEGF e FGF-2, mas somente a inibição de funções induzidas por FGF-2 parece envolver competição com glicosaminoglicanos tipo heparina. A inibição de funções promovidas por VEGF nas células testadas envolveria um diferente mecanismo que ainda não foi elucidado.[EN] Endostatin, the 20 kDa C-terminal fragment of the basement membrane proteoglycan collagen XVIII, is a potent inhibitor of angiogenesis and tumour growth. Given the considerable potential of endostatin as an anti-cancer therapeutic agent, it is important to know its mechanism of action to improve the efficacy of further trials. In this thesis we investigated if endostatin inhibited the cellular effects promoted by FGF-2 and VEGF, by competing for binding to heparan sulfate molecules. We employed two differents cellular models, human microvessel endothelial cells (HMVEC) and neural precursor cells from rat cerebral cortex. Initially, we established a proliferation assay using HMVEC, stimulated by VEGF and FGF-2. Endostatin inhibited 79 and 95% of the FGF-2 and VEGF165-stimulated proliferation, respectively. Heparin was employed to confirm if that inhibitory effect involved competition for GAGs. The stimulatory effect of VEGF165 was not affect by the presence of exogenous heparin, while that of FGF-2, was further enhanced in the presence of up to 0,1 µg/ml heparin. Addition of protamine, a highly basic heparin-binding protein, completely blocked FGF-2-stimulated proliferation, while it did not affect the response to VEGF165. Simultaneous addition of endostatin and protamine led to additive effects both in inhibition of proliferation and induction of apoptosis. Although it had been previously observed that FGF-2 presented higher affinity for heparin than endostatin as judged by their binding to a heparin-sepharose column, endostatin affected the formation of heparin-protamine complexes in solution while FGF-2 did not. Endostatin affected the differentiation of neural progenitors cells induced by FGF-2 and inhibit their maturation into neurons promoted by VEGF.Our results suggest that endostatin inhibits FGF-2 signaling by interfering with its binding to cell-associated heparan sulfate, whereas its counteracting effect relative to VEGF is mediated by a different mechanism that remains to be elucidated.